Μελέτη της προσθήκης παραπροϊόντων της διεργασίας παραγωγής χάρτου στη φυσιολογική συμπεριφορά στελεχών του μικροοργανισμού Rhodosporidium toruloides κατά την αύξηση τους σε υποστρώματα με βάση τη ξυλόζη

Abstract

Σκοπός της παρούσας ερευνητικής εργασίας είναι η μελέτη της επίδρασης του λιγνοσουλφονικού νατρίου, το οποίο ανήκει στο ρεύμα παραπροϊόντων της βιομηχανίας χάρτου, στην κυτταρική ανάπτυξη και την παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών (μικροβιακό λίπος και ενδοπολυσακχαρίτες) της ελαιογόνου ζύμης Rhodosporidium toruloides. Τα μικροβιακά λιπίδια και ειδικότερα αυτά που παράγονται από ελαιογόνους ζύμες, έχουν λάβει μεγάλη προσοχή ως πιθανές εναλλακτικές πηγές για παραγωγή 2ης γενιάς βιοντήζελ. Απώτερος σκοπός της μελέτης είναι να διαπιστωθεί αν η προσθήκη λιγνοσουλφονικού νατρίου οδηγεί σε ενίσχυση της βιοσυσσώρευσης μικροβιακού λίπους, κατά τρόπο ώστε τα υγρά απόβλητα της βιομηχανίας παραγωγής χάρτου (spent sulfite liquor) να μπορούσαν να αξιοποιηθούν ως υπόστρωμα για την καλλιέργεια της ζύμης R.toruloides. Στα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιήθηκαν δύο στελέχη της ζύμης Rhodosporidium toruloides (R.toruloides), το DSM 444 και το NRRL Y-27012. Όλες οι ζυμώσεις περιείχαν σαν μοναδική πηγή άνθρακα την ξυλόζη και έλαβαν χώρα σε περιοριστικές σε άζωτο συνθήκες. Αρχικά, πραγματοποιήθηκαν καλλιέργειες βυθού σε κωνικές φιάλες Erlenmeyer των 250 ml, χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα ξυλόζη, με αρχική συγκέντρωση 50 g/L. Σε πρώτο επίπεδο δεν προστέθηκε στις καλλιέργειες λιγνοσουλφονικό νάτριο. Αυτές οι ζυμώσεις αποτέλεσαν τις ζυμώσεις αναφοράς. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις, στις οποίες επικράτησαν οι ίδιες συνθήκες με τις ζυμώσεις αναφοράς (pH=6,0±0,2, ανάδευση: 180±5 rpm, T=28±1℃). Επίσης, η σύσταση του θρεπτικού υλικού ήταν ίδια με αυτή των ζυμώσεων αναφοράς με την μόνη διαφορά ότι προστέθηκαν 10g/L, 20g/L και 40g/L λιγνοσουλφονικού νατρίου, αντίστοιχα. Τέλος, πραγματοποιήθηκε ημι-συνεχής τροφοδοτούμενη ζύμωση του στελέχους NRRL Y-27012 σε βιοαντιδραστήρα όγκου 3L και ενεργού όγκου 1,5 L στις προηγούμενες αριστοποιημένες συνθήκες. Σε όλες τις προαναφερθείσες ζυμώσεις πραγματοποιήθηκε ο ποσοτικός προσδιορισμός της ξηρής βιομάζας, καθώς και του παραγόμενου μικροβιακού λίπους. Επίσης, πραγματοποιήθηκε ο προσδιορισμός των ενδοπολυσακχαριτών. Το παραγόμενο λίπος ύστερα από μεθυλεστεροποίηση που πραγματοποιήθηκε οδηγήθηκε για ανάλυση στον αέριο χρωματογράφο. Στις ζυμώσεις βυθού, που πραγματοποιήθηκαν για το στέλεχος DSM 4444, βρέθηκε ότι η μεγαλύτερη παραγωγή βιομάζας παρατηρήθηκε στη ζύμωση με την προσθήκη 40 g/L SL, η οποία έφθασε τα 18,6 g/L. Η μεγαλύτερη παραγωγή λίπους παρατηρήθηκε στη ζύμωση με την προσθήκη 20 g/L SL, η οποία έφθασε τα 4,77 g/L, ενώ το μέγιστο ποσοστό ενδοπολυσακχαριτών επί ξηράς ουσίας παρατηρήθηκε στη ζύμωση, στην οποία δεν υπήρξε προσθήκη SL και είχε τιμή 0,31 g/g. Στις ζυμώσεις του στελέχους NRRL Y-27012, η μεγαλύτερη παραγωγή λίπους παρατηρήθηκε στη ζύμωση με την προσθήκη 10 g/L SL, η οποία έφθασε τα 5,30 g/L. Η μέγιστη τιμή βιομάζας παρατηρήθηκε στη ζύμωση με την προσθήκη 40 g/L SL, η οποία έφθασε τα 15,2 g/L, ενώ το μέγιστο ποσοστό ενδοπολυσακχαριτών επί ξηράς ουσίας παρατηρήθηκε στη ζύμωση, στην οποία δεν υπήρξε προσθήκη SL και είχε τιμή 0,30 g/g. Στη ζύμωση, που έλαβε χώρα στο βιοαντιδραστήρα, το λίπος έφτασε τα 17,00 g/L, η βιομάζα έφτασε τα 29,7 g/L και το μέγιστο ποσοστό ενδοπολυσακχαριτών επί ξηράς ουσίας ήταν 0,19 g/g. Με την βοήθεια της αέριας χρωματογραφίας βρέθηκε ότι το μικροβιακό λίπος που παράχθηκε και από τα δύο στελέχη DSM 4444 και NRRL Y-27012 αποτελούταν από τα ακόλουθα λιπαρά οξέα: παλμιτικό οξύ (C16:0), στεατικό οξύ (C18:0), ελαϊκό οξύ (Δ9C18:1) , λινελαϊκό οξύ (Δ9,12C18:2) και α-λινολενικό οξύ (Δ9,12,15C18:3), με κυρίαρχο λιπαρό οξύ σε όλες τις ζυμώσεις να αποτελεί το ελαϊκό οξύ (Δ9C18:1).

The aim of this study is to explore the effect of sodium lignosulfonate, which belongs to the paper industry's by-products, on the cell growth and production of secondary metabolites (microbial fat and intracellular polysaccharides) of the yeast Rhodosporidium toruloides (R.toruloides). Microbial oil, and particularly the one produced by oleaginous yeasts, is drawing increasing interest all over the world as an alternative non-food feedstock for biodiesel production. The ultimate aim of the study is to determine whether the addition of sodium lignosulfonate enhances the lipid accumulation, in order that spent sulfite liquor could be used as substrate for cultivation of yeast R.toruloides. In the experiments conducted, two strains of Rhodosporidium toruloides, namely DSM 444 and NRRL Y-27012, were used. All cultures contained xylose as nominal sole source of carbon and nitrogen-limiting conditions prevailed. Firstly, submerged fermentations were conducted in Erlenmeyer flasks 250 ml, using xylose as a carbon source at initial concentration of 50 g/L. At the first level, sodium lignosulfonate was not added to the cultures. The aforementioned cultures formed the reference point for the subsequent cultures (i.e. controls). Then, fermentations were carried out in the same conditions as the controls (pH = 6,0 ± 0,2, (180 ± 5 rpm), T = 28 ± 1 °C), with the exception that sodium lignosulphonate at concentration of 10 g/L, 20 g/L and 40 g/L, was added. Finally, a fed-batch fermentation of NRRL Y-27012 strain was carried out in a 3L bioreactor, with working volume of 1,5 L. In all the above-mentioned fermentations carried out, the weight of the dry biomass was determined and the produced microbial fat was quantified. Furthermore, the intracellular polysaccharides were determined. The produced fat, after the methyl esterification conducted, was analysed by using gas chromatograph. In the case of submerged fermentations carried out for DSM 4444 stain, the largest biomass production was observed in the fermentation by adding 40 g/L SL, reaching 18,6 g/L. The maximum fat production was identified in the fermentation by the addition of 20 g/L SL, which reached 4,77 g/L, and the maximum YIPS/X (i.e. g of intracellular polysaccharides formed per g of biomass formed) was observed in the fermentation in which there was no addition of SL and had a value of 0,31 g/g. In the case of fermentations of the NRRL Y-27012 strain, the maximum fat production was detected in the fermentation with the addition of 10 g/L SL, which reached 5,30 g/L. The maximum biomass value was observed in the fermentation by the addition of 40 g/L SL, which reached 15,2 g/L, and the maximum YIPS/X was observed in the control fermentation and had a value of 0,30 g/g. In the case of fed-batch fermentation, the fat reached 17,00 g/L, the biomass reached 29,7 g/L and the maximum YIPS/X was 0,19 g/g. With the help of gas chromatography, it was found that the microbial fat produced by both DSM 4444 and NRRL Y-27012 strains, consisted of the following fatty acids: palmitic acid (C16:0), stearic acid (C18:0), oleic acid (Δ9C18:1), linoleic acid (Δ9,12C18:2) and α-linolenic acid (Δ9,12,15C18:3) with the dominant fatty acid in all the fermentations being oleic acid (Δ9C18:1).