Μελέτη της βιομετατροπής μιγμάτων ακάθαρτης γλυκερόλης και υγρών αποβλήτων ελαιουργείας προς παραγωγή προϊόντων προστιθέμενης αξίας με χρήση στελεχών του ζυμομύκητα Yarrowia lipolytica

Abstract

Τα υγρά απόβλητα ελαιοτριβείου (ΥΑΕ) είναι τα κύρια υποπροϊόντα της επεξεργασίας του ελαιοκάρπου για την παραλαβή του ελαιολάδου. Η εναπόθεση των αποβλήτων αυτών, χωρίς μάλιστα να έχει προηγηθεί κατεργασία, είναι ένα φαινόμενο που παρατηρείται συχνά και αποτελεί μεγάλο παράγοντα ρύπανσης για τις ελαιοκομικές περιοχές και μεγάλο πρόβλημα για την βιομηχανία. Πολλές μελέτες στρέφουν την προσοχή τους στην χρήση υποστρωμάτων με βάση τα υγρά απόβλητα ελαιοτριβείου για διάφορες μικροβιακές ζυμώσεις. Η χρήση και προσθήκη των ΥΑΕ στο μέσο καλλιέργειας διαφόρων μικροοργανισμών, αποτελεί μία ελπιδοφόρο μέθοδο βιοτεχνολογικής επεξεργασίας και απορρύπανσης των απόνερων αυτών με ταυτόχρονη παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Τις τελευταίες δεκαετίες έχει παρατηρηθεί ραγδαία αύξηση στην παραγωγή βιοκαυσίμων, όπως του βιοντίζελ. Παραπροϊόν της παραγωγής βιοντίζελ, είναι η ακάθαρτη γλυκερόλη με εμπορική αξία αρκετά χαμηλή (ή και μηδενική) η οποία παράγεται σε τεράστιες ποσότητες σε παγκόσμιο επίπεδο. Αποτελεί ένα υποσχόμενο υλικό εκκίνησης για παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να διερευνηθεί η ικανότητα των στελεχών της ζύμης Yarrowia lipolytica ACA-YC 5029 και ΑCA-YC 5032 να αναπτύσσoνται σε υποστρώματα με βάση την βιομηχανική γλυκερόλη εμπουτισμένη με υγρά απόβλητα ελαιοτριβείου (ΥΑΕ), σε διάφορες συγκεντρώσεις φαινολικών ουσιών. Η μοναδικότητα της μελέτης έγκειται στο γεγονός ότι για πρώτη φορά μελετάται η ικανότητα της Yarrowia lipolytica να αναπτύσσεται σε συνδυασμό ΥΑΕ-γλυκερόλης για την παραγωγή βιομάζας, μεταβολικών προϊόντων (πολυολών και κιτρικού οξέος) και δευτερογενών μεταβολιτών (μικροβιακό λίπος και ενδοπολυσακχαρίτες). Ουσιαστικά τα ΥΑΕ χρησιμοποιούνται ταυτόχρονα ως υπόστρωμα και ως νερό ζύμωσης προκειμένου να αραιωθεί η (συμπυκνωμένη) ακάθαρτη γλυκερόλη, σε μία προσέγγιση αειφορίας, βιοοικονομίας και προσπάθειας εξοικονόμησης υδάτινων πόρων. Οι καλλιέργειες διενεργήθηκαν σε υπόστρωμα ΥΑΕ με διαφορετικές συγκεντρώσεις φαινολικών ουσιών και σταθερές συνθήκες ανάδευσης και θερμοκρασίας. Η γλυκερόλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν διαχωρισμένη και καθαρότητας 88.5% κατά βάρος. Αρχικά, πραγματοποιήθηκαν καλλιέργειες βυθού σε κωνικές φιάλες Erlenmeyer των 250 ml, χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα γλυερόλη, με αρχική συγκέντρωση ~70 g/L. Σε πρώτο στάδιο δεν προστέθηκαν στις καλλιέργειες Υγρά Απόβλητα Ελαιοτριβείου (ΥΑΕ). Αυτές οι ζυμώσεις αποτέλεσαν τις ζυμώσεις αναφοράς. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις, στις οποίες επικράτησαν οι ίδιες συνθήκες με τις ζυμώσεις αναφοράς (pH=5,5-6,0, ανάδευση: 180±5 rpm, T=28±1℃). Επίσης, η σύσταση του θρεπτικού υλικού ήταν ίδια με αυτή των ζυμώσεων αναφοράς με την μόνη διαφορά ότι προστέθηκαν ΥΑΕ σε ποικίλους όγκους ώστε οι αρχικές συγκεντρώσεις φαινολικών ουσιών (Pho) στο μέσο της καλλιέργειας να είναι ~1g/L, ~2g/L και ~3,5g/L αντίστοιχα. Τέλος, πραγματοποιήθηκε ασυνεχής (batch) και ημι-συνεχής τροφοδοτούμενη ζύμωση (fed-batch) του στελέχους Υ. Lipolytica ACA-YC 5032 σε βιοαντιδραστήρα όγκου 4L και ενεργού όγκου 2L. Όλες οι ζυμώσεις έλαβαν χώρα σε περιοριστικές σε Ν συνθήκες. Σε όλες τις προαναφερθείσες ζυμώσεις πραγματοποιήθηκε ο ποσοτικός προσδιορισμός της ξηρής βιομάζας, καθώς και του παραγόμενου μικροβιακού λίπους. Επίσης, πραγματοποιήθηκε ο προσδιορισμός των ενδοπολυσακχαριτών. Το παραγόμενο λίπος ύστερα από μεθυλεστεροποίηση που πραγματοποιήθηκε οδηγήθηκε για ανάλυση στον αεριοχρωματογράφο. Πραγματοποιήθηκαν ακόμα αναλύσεις αποφαινόλωσης και αποχρωματισμού σε όλες τις ζυμώσεις με προσθήκη ΥΑΕ. Στις ζυμώσεις βυθού, που πραγματοποιήθηκαν, βρέθηκε ότι η μεγαλύτερη παραγωγή βιομάζας παρατηρήθηκε στη ζύμωση αναφοράς του στέλεχος ΑCA-YC 5029, η οποία έφθασε τα 12,3 g/L. Η αντίστοιχη μεγαλύτερη παραγωγή βιομάζας για το στέλεχος ΑCA-YC 5032 έφθασε τα 11,3 g/L και παρατηρήθηκε στην ζύμωση αναφοράς και στις ζυμώσεις με συγκεντρώσεις φαινολικών Pho ~1g/L και Pho ~2g/L. Η μεγαλύτερη παραγωγή λίπους και για τα δύο στελέχη παρατηρήθηκε στη ζύμωση με συγκέντρωση φαινολικών Pho ~2 g/L, η οποία έφθασε τα 2,0 g/L. Η προσθήκη ΥΑΕ στο μέσο της καλλιέργειας δεν επηρέασε τις ζυμώσεις. Η μέγιστη παραγωγή κιτρικού οξέος για το ACA-YC 5029 (Citmax) έφθασε τα 40,2 g/L στην ζύμωση αναφοράς με συντελεστή απόδοσης κιτρικού ως προς το καταναλωθέν υπόστρωμα (YCit/Glol ) ίσο με 0,60 g/g, ενώ για το ACA-YC 5032 έφθασε τα 44,1 g/L στην ζύμωση με συγκέντρωση φαινολικών Pho ~3,5 g/L με YCit/Glol =0,64 g/g. Στην ημισυνεχή τροφοδοτούμενη ζύμωση χωρίς προσθήκη ΥΑΕ, που έλαβε χώρα στο βιοαντιδραστήρα με το στέλεχος ACA-YC 5032, το λίπος έφτασε τα 3,08 g/L, και η βιομάζα έφτασε τα 8,03 g/L. Στην ίδια ζύμωση παρατηρήθηκε και η μέγιστη παραγωγή κιτρικού οξέος απο όλες τις ζυμώσεις, η οποία έφθασε τα 105,7 g/L (YCit/Glol ~0,86 g/g). Από τις αναλύσεις αποφαινόλωσης και αποχρωματισμού, η αποφαινόλωση έφθασε σε ποσοστό ~10% w/w και ο αποχρωματισμός σε ποσοστό ~30% και για τα δύο στελέχη. Με την βοήθεια της αεριοχρωματογραφίας βρέθηκε ότι το μικροβιακό λίπος που παράχθηκε και από τα δύο στελέχη αποτελούνταν από τα ακόλουθα λιπαρά οξέα: παλμιτικό οξύ (C16:0), παλμιτελαϊκό οξύ (Δ9C16:1), στεατικό οξύ (C18:0), ελαϊκό οξύ (Δ9C18:1) , λινελαϊκό οξύ (Δ9,12C18:2), με κυρίαρχο λιπαρό οξύ σε όλες τις ζυμώσεις να αποτελεί το ελαϊκό οξύ (Δ9C18:1). Η αύξηση των φαινολικών στο μέσο της καλλιέργειας, ευνοεί την συσσώρευση λιπιδίων με ολοένα μεγαλύτερο ποσοστό σε ελαϊκό οξύ.

Τα υγρά απόβλητα ελαιοτριβείου (ΥΑΕ) είναι τα κύρια υποπροϊόντα της επεξεργασίας του ελαιοκάρπου για την παραλαβή του ελαιολάδου. Η εναπόθεση των αποβλήτων αυτών, χωρίς μάλιστα να έχει προηγηθεί κατεργασία, είναι ένα φαινόμενο που παρατηρείται συχνά και αποτελεί μεγάλο παράγοντα ρύπανσης για τις ελαιοκομικές περιοχές και μεγάλο πρόβλημα για την βιομηχανία. Πολλές μελέτες στρέφουν την προσοχή τους στην χρήση υποστρωμάτων με βάση τα υγρά απόβλητα ελαιοτριβείου για διάφορες μικροβιακές ζυμώσεις. Η χρήση και προσθήκη των ΥΑΕ στο μέσο καλλιέργειας διαφόρων μικροοργανισμών, αποτελεί μία ελπιδοφόρο μέθοδο βιοτεχνολογικής επεξεργασίας και απορρύπανσης των απόνερων αυτών με ταυτόχρονη παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Τις τελευταίες δεκαετίες έχει παρατηρηθεί ραγδαία αύξηση στην παραγωγή βιοκαυσίμων, όπως του βιοντίζελ. Παραπροϊόν της παραγωγής βιοντίζελ, είναι η ακάθαρτη γλυκερόλη με εμπορική αξία αρκετά χαμηλή (ή και μηδενική) η οποία παράγεται σε τεράστιες ποσότητες σε παγκόσμιο επίπεδο. Αποτελεί ένα υποσχόμενο υλικό εκκίνησης για παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να διερευνηθεί η ικανότητα των στελεχών της ζύμης Yarrowia lipolytica ACA-YC 5029 και ΑCA-YC 5032 να αναπτύσσoνται σε υποστρώματα με βάση την βιομηχανική γλυκερόλη εμπουτισμένη με υγρά απόβλητα ελαιοτριβείου (ΥΑΕ), σε διάφορες συγκεντρώσεις φαινολικών ουσιών. Η μοναδικότητα της μελέτης έγκειται στο γεγονός ότι για πρώτη φορά μελετάται η ικανότητα της Yarrowia lipolytica να αναπτύσσεται σε συνδυασμό ΥΑΕ-γλυκερόλης για την παραγωγή βιομάζας, μεταβολικών προϊόντων (πολυολών και κιτρικού οξέος) και δευτερογενών μεταβολιτών (μικροβιακό λίπος και ενδοπολυσακχαρίτες). Ουσιαστικά τα ΥΑΕ χρησιμοποιούνται ταυτόχρονα ως υπόστρωμα και ως νερό ζύμωσης προκειμένου να αραιωθεί η (συμπυκνωμένη) ακάθαρτη γλυκερόλη, σε μία προσέγγιση αειφορίας, βιοοικονομίας και προσπάθειας εξοικονόμησης υδάτινων πόρων. Οι καλλιέργειες διενεργήθηκαν σε υπόστρωμα ΥΑΕ με διαφορετικές συγκεντρώσεις φαινολικών ουσιών και σταθερές συνθήκες ανάδευσης και θερμοκρασίας. Η γλυκερόλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν διαχωρισμένη και καθαρότητας 88.5% κατά βάρος. Αρχικά, πραγματοποιήθηκαν καλλιέργειες βυθού σε κωνικές φιάλες Erlenmeyer των 250 ml, χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα γλυερόλη, με αρχική συγκέντρωση ~70 g/L. Σε πρώτο στάδιο δεν προστέθηκαν στις καλλιέργειες Υγρά Απόβλητα Ελαιοτριβείου (ΥΑΕ). Αυτές οι ζυμώσεις αποτέλεσαν τις ζυμώσεις αναφοράς. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις, στις οποίες επικράτησαν οι ίδιες συνθήκες με τις ζυμώσεις αναφοράς (pH=5,5-6,0, ανάδευση: 180±5 rpm, T=28±1℃). Επίσης, η σύσταση του θρεπτικού υλικού ήταν ίδια με αυτή των ζυμώσεων αναφοράς με την μόνη διαφορά ότι προστέθηκαν ΥΑΕ σε ποικίλους όγκους ώστε οι αρχικές συγκεντρώσεις φαινολικών ουσιών (Pho) στο μέσο της καλλιέργειας να είναι ~1g/L, ~2g/L και ~3,5g/L αντίστοιχα. Τέλος, πραγματοποιήθηκε ασυνεχής (batch) και ημι-συνεχής τροφοδοτούμενη ζύμωση (fed-batch) του στελέχους Υ. Lipolytica ACA-YC 5032 σε βιοαντιδραστήρα όγκου 4L και ενεργού όγκου 2L. Όλες οι ζυμώσεις έλαβαν χώρα σε περιοριστικές σε Ν συνθήκες. Σε όλες τις προαναφερθείσες ζυμώσεις πραγματοποιήθηκε ο ποσοτικός προσδιορισμός της ξηρής βιομάζας, καθώς και του παραγόμενου μικροβιακού λίπους. Επίσης, πραγματοποιήθηκε ο προσδιορισμός των ενδοπολυσακχαριτών. Το παραγόμενο λίπος ύστερα από μεθυλεστεροποίηση που πραγματοποιήθηκε οδηγήθηκε για ανάλυση στον αεριοχρωματογράφο. Πραγματοποιήθηκαν ακόμα αναλύσεις αποφαινόλωσης και αποχρωματισμού σε όλες τις ζυμώσεις με προσθήκη ΥΑΕ. Στις ζυμώσεις βυθού, που πραγματοποιήθηκαν, βρέθηκε ότι η μεγαλύτερη παραγωγή βιομάζας παρατηρήθηκε στη ζύμωση αναφοράς του στέλεχος ΑCA-YC 5029, η οποία έφθασε τα 12,3 g/L. Η αντίστοιχη μεγαλύτερη παραγωγή βιομάζας για το στέλεχος ΑCA-YC 5032 έφθασε τα 11,3 g/L και παρατηρήθηκε στην ζύμωση αναφοράς και στις ζυμώσεις με συγκεντρώσεις φαινολικών Pho ~1g/L και Pho ~2g/L. Η μεγαλύτερη παραγωγή λίπους και για τα δύο στελέχη παρατηρήθηκε στη ζύμωση με συγκέντρωση φαινολικών Pho ~2 g/L, η οποία έφθασε τα 2,0 g/L. Η προσθήκη ΥΑΕ στο μέσο της καλλιέργειας δεν επηρέασε τις ζυμώσεις. Η μέγιστη παραγωγή κιτρικού οξέος για το ACA-YC 5029 (Citmax) έφθασε τα 40,2 g/L στην ζύμωση αναφοράς με συντελεστή απόδοσης κιτρικού ως προς το καταναλωθέν υπόστρωμα (YCit/Glol ) ίσο με 0,60 g/g, ενώ για το ACA-YC 5032 έφθασε τα 44,1 g/L στην ζύμωση με συγκέντρωση φαινολικών Pho ~3,5 g/L με YCit/Glol =0,64 g/g. Στην ημισυνεχή τροφοδοτούμενη ζύμωση χωρίς προσθήκη ΥΑΕ, που έλαβε χώρα στο βιοαντιδραστήρα με το στέλεχος ACA-YC 5032, το λίπος έφτασε τα 3,08 g/L, και η βιομάζα έφτασε τα 8,03 g/L. Στην ίδια ζύμωση παρατηρήθηκε και η μέγιστη παραγωγή κιτρικού οξέος απο όλες τις ζυμώσεις, η οποία έφθασε τα 105,7 g/L (YCit/Glol ~0,86 g/g). Από τις αναλύσεις αποφαινόλωσης και αποχρωματισμού, η αποφαινόλωση έφθασε σε ποσοστό ~10% w/w και ο αποχρωματισμός σε ποσοστό ~30% και για τα δύο στελέχη. Με την βοήθεια της αεριοχρωματογραφίας βρέθηκε ότι το μικροβιακό λίπος που παράχθηκε και από τα δύο στελέχη αποτελούνταν από τα ακόλουθα λιπαρά οξέα: παλμιτικό οξύ (C16:0), παλμιτελαϊκό οξύ (Δ9C16:1), στεατικό οξύ (C18:0), ελαϊκό οξύ (Δ9C18:1) , λινελαϊκό οξύ (Δ9,12C18:2), με κυρίαρχο λιπαρό οξύ σε όλες τις ζυμώσεις να αποτελεί το ελαϊκό οξύ (Δ9C18:1). Η αύξηση των φαινολικών στο μέσο της καλλιέργειας, ευνοεί την συσσώρευση λιπιδίων με ολοένα μεγαλύτερο ποσοστό σε ελαϊκό οξύ.