Απομόνωση και χαρακτηρισμός ενδοφυτικών μικροοργανισμών από το Hypericum hircinum

Abstract

Τα φαρμακευτικά φυτά είναι γνωστό πως αποτελούν ξενιστές πλήθους ενδοφυτικών μικροοργανισμών, εκ των οποίων πολλοί είναι παραγωγοί σημαντικών βιοενεργών μεταβολιτών. Στην παρούσα μεταπτυχιακή μελέτη ενδοφυτικά βακτήρια και μύκητες απομονώθηκαν από επιφανειακά αποστειρωμένα φύλλα και ρίζα του φαρμακευτικού φυτού Hypericum hircinum. Από 100 βακτηριακές απομονώσεις, 18 επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη με βάση την in vitro ανταγωνιστικότητά τους έναντι του φυτοπαθογόνου μύκητα Rhizoctonia solani. Από 50 ενδοφυτικούς μύκητες, έγινε επιλογή 14 απομονώσεων για περαιτέρω χαρακτηρισμό, η οποία βασίστηκε σε διακριτές μορφολογικές διαφορές. Τα ενδοφυτικά βακτήρια χαρακτηρίστηκαν με βάση τις 16s rDNA αλληλουχίες τους, ενώ οι ενδοφυτικοί μύκητες με βάση των ITS rDNA αλληλουχιών τους. Τα βακτήρια χαρακτηρίστηκαν ως Bacillus sp., B.subtilis, B.cereus, B. amyloliquefaciens και B.licheniformis. Όσον αφορά τους ενδοφυτικούς μύκητες, το κυρίαρχο είδος στα φύλλα ανήκει στο γένος Alternaria, ενώ στον ριζικό ιστό παρατηρείται μεγαλύτερη ποικιλία ενδοφυτικών μυκήτων, όπως Alternaria spp., Pyrenochaeta sp., Acrocalymma vagum και Macrophomina phaseolina. Η ανταγωνιστική ικανότητα των ενδοφυτικών βακτηρίων και μυκήτων μελετήθηκε έναντι των φυτοπαθογόνων μυκήτων Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum f.sp. raphani και Botrytis cinerea με τη μέθοδο της διπλής καλλιέργειας. Η πλειοψηφία των ενδοφυτικών βακτηρίων έδειξαν ανταγωνισμό έναντι των φυτοπαθογόνων με τον σχηματισμό μιας ζώνης παρεμπόδισης. Οι ενδοφυτικοί μύκητες έδειξαν ανταγωνιστική δραστηριότητα μέσω της επαφής, του σχηματισμού ζώνης παρεμπόδισης και της ανάπτυξης του ενός μύκητα πάνω στον άλλον. Τα βακτήρια μελετήθηκαν, επίσης για την ικανότητα ομαδικής κίνησης, αλλά και για παράγοντες που προωθούν την ανάπτυξη του φυτικού οργανισμού, όπως η διαλυτοποίηση του φωσφόρου και η παραγωγή σιδηροφόρων.

Medicinal plants are known to harbour endophytic fungi and bacteria with some of them being the producers of important bioactive metabolites. In the present study endophytic bacteria and fungi were isolated from surfaced sterilized leaves and roots of the medicinal plant Hypericum hircinum. From a total of 100 bacterial isolates, 18 isolates were selected for further studies based on their ability to show antagonistic in vitro activity against the fungal phytopathogens Rhizoctonia solani. The selection of endophytic fungi was based on visible morphological differences, and from the total 50 isolates, 14 isolates were selected for further characterization. Selected bacterial and fungal isolates were identified based on 16S rRNA gene and ITS region analysis, respectively. All of the bacterial isolates grouped into Bacillus genus. The selected bacterial isolates belong to Bacillus sp., B.subtilis, B.cereus, B. amyloliquefaciens and B.licheniformis species. The dominant endofungal species in leaves was Alternaria sp. whereas roots were colonized by a more diverse fungal community composed of Alternaria spp., Pyrenochaeta sp., Acrocalymma vagum and Macrophomina phaseolina. The antagonistic ability of the selected bacteria and fungi was studied against the fungal phytopathogens Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum f.sp. raphani και Botrytis cinerea were evaluated using the dual-culture technique. The majority of the bacterial isolates showed antagonism mainly through formation of inhibition zone. The fungi showed antagonistic activity through contact, inhibition zone and overgrowth. The selected bacteria were also evaluated for the presence of traits involved in plant colonization (swarming motility) and plant growth promotion (production of siderophores and phosphate solubilization).