Ιική επαγόμενη αποσιώπηση (VIGS) του γονιδίου της β-γλυκοσιδάσης της ελαιοευρωπαΐνης σε φυτά ελιάς

Abstract

Την τελευταία δεκαετία, έχει αποδειχθεί ότι πολλά από τα υγιεινά συστατικά που συνιστούν την μεσογειακή διατροφή, εντοπίζονται σε τροφές όπως οι ελιές και το ελαιόλαδο. Ερευνητές από ποικίλους τομείς έχουν επικεντρώσει το ενδιαφέρον τους σε αυτή την καλλιέργεια για να εξετάσουν τα εξειδικευμένα μεταβολικά μονοπάτια και τα συστατικά τους που είναι ωφέλιμα για τον άνθρωπο. Πιθανώς οι πιο ελπιδοφόροι δευτερογενείς μεταβολίτες είναι τα ολεοσίδια. Οι ελιές (Olea europaea ssp. Europaea) παράγουν ασυνήθιστα σεκοϊριδοειδή (secoiridoids) τα οποία απαντώνται σχεδόν αποκλειστικά στα μέλη της οικογένειας Oleaceae. Σε αρκετές φαρμακευτικές μελέτες έχουν επισημανθεί τα πολυδύναμα και βιοδραστικά χαρακτηριστικά αυτών των ενώσεων. Λόγω της εξαιρετικά στενής ταξινομικής κατανομής τους, οι γνώσεις μας σχετικά με τους ενζυματικούς κόμβους που διέπουν τη βιομετατροπή των ελαιο-σεκοϊριδοειδών είναι λιγοστές. Πρόσφατα εντοπίσαμε μια β-γλυκοσιδάση (OeGLU) η οποία δρα εξειδικευμένα για την απογλυκοζυλίωση της ελαιοευρωπαΐνης - το κυρίαρχο σεκοριδοειδές στην ελιά - που παράγει την βιοδραστική αμυντική άγλυκη μορφή της. Η αλληλούχιση διαφόρων γονιδιωμάτων αποκάλυψε ότι τα φυτά περιέχουν ένα μεγάλο σύνολο β-γλυκοσιδάσων αποτελούμενου από έως και 40 μέλη. Ο πλήρης χαρακτηρισμός ενός γονιδίου θα πρέπει ιδανικά να συμπληρώνεται με γενετική ανάλυση, ωστόσο αυτή η προσέγγιση σε πολυετή είδη Oleaceae είναι εξαιρετικά δύσκολη. Για να ξεπεραστεί αυτό το μειονέκτημα, εφαρμόσαμε μια τεχνική αναστροφής γενετικής με χρήση συγκεκριμένων ιών φορέων με στόχο την σίγηση γονιδίων (μέθοδος VIGS) σε φυτά ελιάς. Η επιτυχής σίγηση του γονιδίου OeGLU επιβεβαιώθηκε με RT-PCR. Χρησιμοποιώντας ανάλυση HPLC για τη μέτρηση της σχετικής ενζυμικής δραστηριότητας μεταξύ φυτών που χειριστήκαμε με την μέθοδο VIGS και φυτών μαρτύρων, αποκαλύφθηκε ότι η OeGLU είναι αποκλειστικά υπεύθυνη για την απογλυκοζυλίωση της ελαιοευρωπαΐνης στο ελαιόδενδρο. H προσέγγιση αυτή είναι ένα ισχυρό εργαλείο για την αποσαφήνιση και το χαρακτηρισμό της πολύπλοκης βιοσυνθετικής οδού των secoiridoids στην οικογένεια των Oleaceae και συμβάλλει επίσης στην ανεύρεση και μετέπειτα παραγωγή ορισμένων ενδιαμέσων, ευεργετικών μεταβολιτών για την ανθρώπινη υγεία.

Over the last decade, many healthy constituents of the Mediterranean diet have been attributed to olives and olive oil. Researchers from diversified fields have focused their interest in this crop in order to unravel which specialized metabolic components and aspects are beneficial to humans. Probably the most promising secondary metabolites are oleosides. Olives (Olea europaea ssp. europaea) produce these unusual secoiridoids which are almost exclusively found in members of the Oleaceae family. Several pharmaceutical studies have highlighted the pluripotent and bioactive characteristics of these compounds. Due to their extremely narrow taxonomic distribution, our knowledge concerning the enzymatic hubs that govern the biotransformation of the olive secoiridoids is scarce. We have recently identified a β-glucosidase (OeGLU) that specifically deglycosylates oleuropein - the dominant secoiridoid in olive - producing the bioactive defensive aglycone form. Sequencing of various genomes has revealed that plants contain a large set of β-glucosidases consisting of up to 40 members. The complete characterization of a gene should ideally be complemented with genetic analysis, however this approach using the recalcitrant perennial Oleaceae species is extremely difficult. To overcome this drawback, we have introduced the Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) approach to the olive tree. Successful silencing of OeGLU was confirmed by RT-PCR. Using HPLC analysis to measure the relative enzymatic activity among silenced and wild type plants, revealed that OeGLU is solely responsible for the deglycosylation of oleuropein in the olive tree. This approach is a powerful tool to elucidate and characterize the complex secoiridoid biosynthetic pathway in the Oleaceae family, and to manipulate certain intermediates of the pathway in planta in order to increase the quantity of the most beneficial for human health.