Βιο- επεξεργασία παραπροϊόντων ιχθύων για την παραγωγή ενζύμων υψηλής προστιθέμενης αξίας

Abstract

Η κυτταρίνη αποτελεί ένα από τα άφθονα υλικά στον πλανήτη. Το συγκεκριμένο υλικό συσσωρεύεται στο περιβάλλον μέσα από πολλές διεργασίες καθώς η βιομηχανία χαρτιού συμβάλλει σημαντικά στο ποσοστό των εκπεμπόμενων ρύπων στο περιβάλλον, όπως για παράδειγμα τα λιγνινοκυτταρινούχα υλικά. Πολλές μελέτες, έχουν πραγματοποιηθεί για να βρεθεί ένας οικονομικός και παράλληλα φιλικός προς το περιβάλλον τρόπος για την αξιοποίηση της κυτταρίνης. Οι πρωτεάσες είναι ένζυμα που υδρολύουν πεπτιδικούς δεσμούς ανάμεσα σε αμινοξικά κατάλοιπα πολυπεπτιδικών αλυσίδων και είναι το σημαντικότερο βιοτεχνολογικό ένζυμο αποτελώντας το 75% της αγοράς των βιοτεχνολογικών ενζύμων. Χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία τροφίμων, ζωοτροφών, κλωστοϋφαντουργία, απορρυπαντικών, φαρμάκων, μεταποιητικές βιομηχανίες επεξεργασίας χαρτιού και χαρτοπολτού, επεξεργασία δέρματος και στη γεωργία. Σκοπός της παρούσας έρευνας ήταν η δημιουργία και αξιολόγηση χρωματογραφικών προσροφητών συγγένειας και στη συνέχεια ο καθαρισμός πρωτεασών από παραπροϊόντα ιχθυοκαλλιέργειας (πεπτικό σύστημα ψαριών). Στο πρώτο στάδιο, δημιουργήθηκαν προσροφητές συγγένειας χρησιμοποιώντας σαν χρωματογραφικό υλικό κυτταρίνη που απομονώθηκε από ανακυκλώσιμα υλικά/παραπροϊόντα (εφημερίδα). Σαν δεσμευτής χρησιμοποιήθηκε η μονοχλωροτριαζινο-χρωστική Cibacron Blue 3GA. Η αντίδραση σύνδεσης της χρωστικής στην κυτταρίνη πραγματοποιείται μέσω νουκλεόφιλης προσβολή του υδροξυλίου της κυτταρίνης στο ηλεκτρονιόφιλο χλώριο του τριαζινικού δακτυλίου της χρωστικής. Η αντίδραση ακινητοποίησης πραγματοποιείται σε θερμοκρασία 60°C εξαιτίας της μειωμένης δραστικότητας του μονοχλωροτριαζινικού δακτυλίου. Αρχικά, μελετήθηκε η ποσότητα χρωστικής που ακινητοποιήθηκε με βάση την επεξεργασία ή όχι με υδροχλωρικό οξύ για την αύξηση του αριθμού των διαθέσιμων υδροξυλίων της κυτταρίνης και το χρόνο της αντίδρασης (4.5 και 7.5 ώρες). Στη συνέχεια, για τον προσροφητή με την υψηλότερη συγγέντρωση ακινητοποιημένης χρωστικής μελετήθηκε με μετωπική ανάλυση η χωρητικότητα του χρησιμοποιώντας δύο πρότυπες πρωτεΐνες (αλβουμίνη και λυσοζύμη). Επίσης, μελετήθηκε η ισορροπία και η κινητική προσρόφησης των πρωτεϊνών στον προσροφητή. Τα αποτελέσματα για την ισορροπία προσρόφησης έδωσαν καλύτερη προσαρμογή στο πρότυπο του Langmuir (R2=0,9578 για την αλβουμίνη και R2=0,9964 για τη λυσοζύμη) γεγονός το οποίο δείχνει ότι τα συστήματα BSA-CELL-CB3GA και Lys-CELL-CB3GA, ακολουθούν το μοντέλο επαρκώς. Η παράμετρος qmax, δηλαδή η μέγιστη χωρητικότητα της προσροφημένης πρωτεΐνης (mg/g προσροφητή) βρέθηκε ίση με 3.9 mg/g προσροφητή για την αλβουμίνη και 5.7 mg/γρ προσροφητή για τη λυσοζύμη. Στο δεύτερο στάδιο, μελετήθηκε η χρωματογραφική συμπεριφορά του προσροφητή και χρησιμοποιήθηκε για απομόνωση πρωτεασών. Σαν βιολογικά υλικά χρησιμοποιήθηκαν εκχυλίσματα στομάχου και παγκρέατος από το είδος Sparus aurata. Για τη βελτίωση της χωρητικότητας και της χρωματογραφικής συμπεριφοράς του προσροφητή μελετήθηκε η προσρόφηση των πρωτεασών σε διαφορετικές τιμές pH για τα διαλύματα εξισορρόπησης, πλύσης και έκλουσης. Χρησιμοποιώντας συγκεκριμένες τιμές επιτεύχθηκε απόδοση καθαρισμού των πρωτεασών 168% και 113% από το στομάχι και το πάγκρεας με καθαρισμό 47- και 34-φορές αντίστοιχα. Όσον αφορά τις σερινοπρωτεάσες θρυψίνη και χυμοθρυψίνη από το πάγκρεας παρατηρήθηκε απόδοση καθαρισμού 49.5% και 18.85% με καθαρισμό 15- και 5-φορές αντίστοιχα. Η καθαριστική ικανότητα του προσροφητή κρίθηκε σε μεγάλο βαθμό ικανοποιητική καθώς αρχικός στόχος ήταν η εύρεση ενός πρωτοκόλλου καθαρισμού των ενζύμων με όσον το δυνατόν λιγότερα στάδια και με πολύ χαμηλό κόστος.

Cellulose is one of the most abundant materials on Earth. This particular material accumulates in the environment through several processes, as paper industries contribute in the percent of the emitted pollutants, such as lignocellulose materials, in a great manner. Numerous studies have been conducted to find an economical and environmentally friendly method to reuse cellulose. Proteases are enzymes that hydrolyze peptide bonds between amino acids and constitute 75% of the biotechnological enzyme market. They find many different uses in food industry, animal feed, textiles, detergents, pharmaceuticals, industries for paper and paper pulp processing, leather processing and agriculture. The purpose of the current study was the design, synthesis and evaluation of affinity chromatography adsorbents for protease purification from fish farming byproducts (fish digestive system). In the first step, affinity adsorbents were synthesized using cellulose as matrix. Cellulose was isolated from recycled products (waste newspaper). As affinity ligand, the monochlorotriazine dye Cibacron Blue 3GA was used. The immobilization of the triazine dye to cellulose is achieved through nucleophilic substitution reaction of the hydroxyl group of cellulose fibers on the electrophilic chloride center of the dye. The immobilization reaction takes place at high temperature (60oC) due to low reactivity of the monochlorotriazine ring. The immobilized dye concentration was measured in two different cellulose isolations (with or without acid treatment) using two different immobilization reaction times (4.5 and 7.5h). The next step was the determination of the binding capacity of the affinity adsorbent employing two standard proteins (Bovine Serum Albumin and Lysozyme, BSA). This was achieved by frontal analysis and absorption equilibrium studies. The results showed that the binding of proteins to the affinity adsorbent obey the Langmuir model (R2 value, R2=0,9578 for BSA και R2=0,9964 for Lysozyme). The maximum binding capacity (qmax), was calculated equal to 3.9 mg/gr and 5.7 mg/gr of adsorbent for BSA and Lysozyme respectively. The second objective of the study was to evaluate the affinity chromatography behavior of the affinity adsorbent towards proteases from fish waste. As a source of proteases the stomach and pancreas from Sparus aurata (Mediterranean bream) was used. Different pH values were studied for the equilibration, wash and elution values. Using suitable conditions a 168% and 113% of recovery was achieved for the proteases from the stomach and pancreatic extract, respectively. In the case of the trypsin and chymotrypsin, from Sparus aurata pancreas, a 49.5% and 18.85% recovery was achieved, respectively. The results showed that the Cibacron Blue 3GA affinity adsorbent can be used for the partial purification of proteases from crude Sparus aurata extracts.