Παραγωγή βιογενών χρωστικών ουσιών μέσω μικροβιακής ζύμωσης, με τη χρήση του μύκητα Penicillium purpurogenum

Abstract

Στην παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή, τέθηκε υπό μελέτη το ζήτημα της αξιοποίησης απόβλητων φρούτων από τις λαϊκές αγορές, με απώτερο στόχο τόσο τη δημιουργία βιοδιυλιστηρίου και την παραλαβή προϊόντων προστιθέμενης αξίας, λόγου χάρη τα αντιοξειδωτικά συστατικά, οι πηκτίνες και το λιμονένιο, όσο και την παραγωγή φυσικών χρωστικών ουσιών μέσω μικροβιακής ζύμωσης, σε υγρές καλλιέργειες (SubmergedFermentations), καθώς και σε ζυμώσεις στερεάς κατάστασης (SolidStateFermentations). Η μελέτη της σύστασης των φρούτων αποτέλεσε πρωταρχικό και καθοριστικό βήμα στην έναρξη της έρευνας, καθώς βάσει αυτής αξιολογήθηκε η καλύτερη μέθοδος αξιοποίηση των αποβλήτων. Εν συνέχεια, μελετήθηκε ο βέλτιστος τρόπος της δημιουργίας του βιοδιυλιστηρίου, όντας ως στόχος η άρτια και επιτυχής παραλαβή των αντιοξειδωτικών συστατικών και από τα δύο απόβλητα φρούτα, καθώς ακόμα και η παραλαβή των πηκτινών και του αιθέριου ελαίου από το μήλο και το φλοιό πορτοκαλιού, αντίστοιχα. Ο διαχωρισμός των φαινολικών συστατικών από το υπόλοιπο μέρος του μήλου πραγματοποιήθηκε τόσο με τη χρήση υδατόλουτρο υπερήχων, όσο και με τη χρήση επωαστήρα υπό ανάδευση, καθώς και με τη χρήση διαφόρων διαλυτών (EtOH, EtOH/HCl, MeOHκαι MeOH/HCl). Στόχος των δοκιμών αυτών ήταν η διαπίστωση των βέλτιστων συνθηκών παραλαβής των αντιοξειδωτικών συστατικών. Αντίθετα, για το φλοιό πορτοκαλιού, επιλέχθηκε αποκλειστικά η χρήση του υδατόλουτρου υπερήχων και του συνδυασμού διαλυτών EtOH/HCl. Όσον αφορά στις πηκτίνες, αυτές παρελήφθησαν από το μήλο μέσω όξινης υδρόλυσής τους, με τη χρήση αντιδραστηρίων, ενώ τέλος η μέθοδος της απόσταξης επιλέχθηκε για την παραλαβή του λιμονένιου από το φλοιό του πορτοκαλιού. Παράλληλα με την εξέλιξη του βιοδιυλιστηρίου, πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις σε συνθετικό υπόστρωμα με στελέχη του μύκητα Penicilliumpurpurogenum. Τα εμπορικά υποστρώματα του CzapekBroth, του TSBBrothκαι του YMBχρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη του μικροοργανισμού και την παραγωγή εξωκυτταρικής χρωστικής. Ακολούθησαν υγρές καλλιέργειες με υπόστρωμα αποτελούμενο από διάλυμα αλάτων και σάκχαρα της σακχαρόζης, της γλυκόζης και της φρουκτόζης, συγκέντρωσης 30 g/Lτο καθένα, καθώς και ζυμώσεις οι οποίες πέρα από τα παραπάνω περιείχαν ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού οξέος-κιτρικού νατρίου (7,66και 18,6 g/L, αντίστοιχα) και διάλυμα εκχυλίσματος ζύμης (50 g/L). Οι υγρές καλλιέργειες με εμπορικά υποστρώματα ολοκληρώθηκαν με ζυμώσεις στις οποίες επιλέχθηκαν διάφορες αναλογίες C/N. Με πηγή άνθρακα τη σακχαρόζη και τη γλυκόζη σε συγκεντρώσεις 30, 50 και 70 g/L και με μεταβλητή πηγή αζώτου το διάλυμα εκχυλίσματος ζύμης, η ανάπτυξη του μύκητα πραγματοποιήθηκε στις αναλογίες 5:1, 10:1, 20:1, 40:1, 60:1 και 80:1. Κατά τη διάρκεια των παραπάνω πειραμάτων, αξιολογήθηκε η παραγωγή ενδοκυτταρικών και εξωκυτταρικών χρωστικών, η εκχύλιση αυτών και η κατανάλωση των σακχάρων, του ανόργανου φωσφόρου και του αζώτου των ελεύθερων αμινομάδων. Στην αναλογία C/N20:1 η μέγιστη απορρόφηση της κόκκινης χρωστικής ήταν στα 0,11 AU/mL, ενώ σε αυτή την αναλογία πραγματοποιήθηκαν οι υγρές καλλιέργειες, στις οποίες ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκαν τα φυσικά σάκχαρα από το μήλο. Από την άλλη, οι φλοιοί πορτοκαλιού αποτέλεσαν την πηγή άνθρακα για την ανάπτυξη του μύκητα στις ζυμώσεις στερεάς κατάστασης, στις οποίες η υγρασία του υποστρώματος ήταν στο 65 %.

The issue of the utilization of fruit waste from the public markets was studied, with the ultimate goal of creating both a biorefinery and the receipt of added value products such as antioxidant components, pectins and limonene, as well as its exploitation residual fraction for the production of natural pigments through microbial fermentations, using the fungus Penicillium purpurogenum.Fruits were valorized through biorefinery development in order to extract value added products, like antioxidant compounds, pectins from apples and the essential oils from orange peel. The separation of phenolic compounds from apple waste was carried out using an ultrasonic water bath and a shaker incubator as well as various solvents (EtOH, EtOH/HCl, MeOH and MeOH / HCl). The aim of these experiments was to optimize antioxidant extraction. Pectin extraction from apples was achieved using acid hydrolysis. D-limonene was extracted from orange peels through distillation.The remaining sugars or complex polysaccharides were then evaluated for microbial pigment production. Fermentations were performed on synthetic substrate with strains of Penicillium purpurogenum. The commercial substrates of Czapek Broth, TSB Broth and YMB were used for the production of the extracellular and intracellular pigment. Submerged fermentations were carried out in a synthetic substrate with commercial sugars (sucrose, glucose and fructose). Subsequently, fermentations were carried out using a solution of salts was used as a buffer. Submerged fermentations with commercial substrates were also carried out at various C/N ratios, at carbon concentrations of 30, 50 and 70 g/L with a variable nitrogen source of yeast extract solution, resulting in C/N ratios of 5:1, 10:1, 20:1, 40:1, 60:1 and 80:1. During the experiments, the production of intercellular and extracellular pigment and the consumption of sugars, inorganic phosphorus and free amino nitrogen were evaluated, while phenolic components and antioxidant capacity were determined. The natural sugars of the apple were used in submerged fermentations in which the C/N ratio was 20:1. On the other hand, orange peels were used for solid state fermentation at initial moisture content of 65 %.