Μελέτη της in vitro αλληλεπίδρασης του Clonostachys rosea με ενδοφυτικά βακτήρια και μύκητες

Abstract

Ο μύκητας Clonostachys rosea μπορεί να αποικίσει τους υπέργειους και υπόγειους ιστούς των ζωντανών φυτών, είτε ενδοφυτικά, είτε επιφυτικά. Αναγνωρίζεται ως ωφέλιμος οργανισμός καθώς είναι ένας αποτελεσματικός ανταγωνιστής έναντι πλήθους φυτοπαθογόνων, ενώ συχνά εφαρμόζεται ως παράγοντας βιολογικού ελέγχου (BCA), είτε ως μεμονωμένο στέλεχος, είτε σε συνδυασμό (μείγματα πολλαπλών στελεχών) με άλλους παράγοντες BCA. Η παρασκευή ενός μείγματος που βασίζεται σε πολλαπλά στελέχη του C. rosea, απαιτεί προσεκτική μελέτη δεδομένου ότι αυτοί οι μύκητες παρουσιάζουν συνήθως υψηλή ανταγωνιστική δράση κατά τη συνύπαρξή τους με βακτηριακούς και μυκητιακούς παράγοντες βιολογικού ελέγχου εντός του ίδιου είδους ή μεταξύ διαφορετικών ειδών. Στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε τις in vitro ανταγωνιστικές αλληλεπιδράσεις δύο στελεχών C. rosea, Clon.1 και Clon.2, με ωφέλιμους ενδοφυτικούς μύκητες (Trichoderma sp., Beauveria bassiana, Metarhizium sp.) και ενδοφυτικά βακτήρια απομονωμένα από το φαρμακευτικό φυτό Calendula officinalis. Παράλληλα, εξετάσαμε τις ανταγωνιστικές αλληλεπιδράσεις των στελεχών C. rosea με διαφορετικούς φυτοπαθογόνους μύκητες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι παρ’ όλο που υπάρχει μία ανταγωνιστική δράση (overgrowth) στα αρχικά στάδια της συγκαλλιέργειας μεταξύ των δύο στελεχών C. rosea, σε μεταγενέστερα στάδια της συγκαλλιέργειας η ανταγωνιστική δράση τους είναι ισορροπημένη και τα δύο στελέχη μυκήτων μπορούν να συνυπάρχουν. Ταυτόχρονα, και τα δύο στελέχη C. rosea ήταν πολύ ανταγωνιστικά έναντι των φυτοπαθογόνων μυκήτων που μελετήθηκαν. Σε αλληλεπίδραση με τον μύκητα Trichoderma sp. τα δύο στελέχη C. rosea συνυπάρχουν μαζί του, ενώ ήταν ιδιαίτερα ανταγωνιστικά έναντι του Metarhizium sp.. Τέλος, μελετήθηκε η αλληλεπίδρασή τους με τον Β. bassiana και βρέθηκε ότι το στέλεχος Clon.1 ήταν εξαιρετικά ανταγωνιστικό εναντίον του, σε σύγκριση με το Clon.2, όπου μπορεί και συνυπάρχει με τον εντομοπαθογόνο μύκητα. Όλα τα εξεταζόμενα ενδοφυτικά βακτήρια (Cal.r.1, Cal.r.11 και Cal.l.30) ήταν ιδιαίτερα ανταγωνιστικά έναντι του C. rosea. Κατά τη διάρκεια της αλληλεπίδρασης του Cal.r.11 ή Cal.l.30 με τα στελέχη Clonostachys rosea σχηματίστηκε αρχικά μια μεγάλη ζώνη αναστολής μεταξύ των βακτηρίων και των δύο στελεχών του Clonostachys sp.. Ωστόσο, κατά τη διάρκεια του ανταγωνισμού, το πλάτος της ζώνης αναστολής μειώθηκε σταδιακά. Οι μύκητες αναπτύχθηκαν και κατέλαβαν την περιοχή που είχε οριστεί προηγουμένως ως ζώνη αναστολής, με πιθανή αποτοξικοποίηση των βακτηριακών αντιβιοτικών ενώσεων. Έτσι, η συνύπαρξη των στελεχών του Clonostachys rosea με αυτά τα βακτήρια είναι δυνατή εφ' όσον περιορίζονται χωρικά. Κατά τη διάρκεια της αλληλεπίδρασης του Cal.r.1 με το Clon.2 είχε σχηματιστεί αρχικά μια ζώνη αναστολής, η οποία ωστόσο μειώθηκε σε μεταγενέστερα στάδια της αλληλεπίδρασης. Σε αντίθεση με τον Clon.2, το βακτήριο φαίνεται να εισβάλλει στο αναπτυσσόμενο στέλεχος Clon.1 και να προκαλεί καταστροφή των μυκηλιακών υφών του. Παρόμοια μελέτη πραγματοποιήθηκε και με το μύκητα Trichoderma sp.. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο μυκοπαρασιτικός μύκητας Trichoderma sp. είναι εξαιρετικά ανταγωνιστικός έναντι όλων των φυτοπαθογόνων μυκήτων καθώς και έναντι του Metarhizium sp.. Ωστόσο, μπορεί να συνυπάρχει με τον μύκητα B. bassiana.

The fungus Clonostachys rosea can colonize aboveground and underground tissues of living plants either endophytically or epiphytically. C. rosea is recognized as a beneficial organism, because it is an effective antagonist against fungal pathogens of agricultural and horticultural crops, and it is often used as biological control agent (BCA) either singly or in a combination (multi-strain mixtures) with other fungal or bacterial BCA agents. However, construction of a C. rosea based multi-strain mixture since these fungi usually show high intra-species or inter-species antagonistic activity with both bacterial and fungi biocontrol agents. In the present study, we examined the in vitro antagonistic interactions of two C. rosea isolates, Clon.1 and Clon.2, with beneficial endophytic fungi (Trichoderma sp., Beauveria bassiana, Metarhizium sp.) and endophytic bacteria isolated from Calendula officinalis. In parallel, we also examined the antagonistic interactions of C. rosea strains with different fungal pathogens. The data demonstrated that, although there is an antagonistic activity (overgrowth) at the initial stages of co-culture between two C. rosea isolates, at later stages of co-cultivation their antagonistic activity is balanced, and the two fungal strains may co-exist. Both C. rosea isolates were highly antagonistic against fungal phytopathogens. Also, both C. rosea strains were highly antagonistic against Metarhizium sp., but may co-exist with Trichoderma sp.. The isolate Clon.1 was highly antagonistic against B. bassiana, whereas Clon.2 may coexist with the entomopathogenic fungi B. bassiana. All the examined endophytic bacteria (Cal.r.11, Cal.l.30 and Cal.r.1) were highly antagonistic against C. rosea. During the interaction of Cal.r.11 or Cal.l.30 with the Clonostachys rosea strains initially a large inhibition zone was formed between the bacteria and both C. rosea. However, in the course of competition the width of inhibition zone was gradually reduced. The fungi advanced and occupied the territory previously defines as inhibition zone possibly by detoxifying the secreted bacterial antibiotic compounds. Thus, the co-existence of Clonostachys with these bacteria is possible as long as they are spatially separated. During the interaction of Cal.r.1 with the Clon.2 strain initially a large inhibition zone was formed, which however reduced at later stages of interaction. In contrast, Cal.r.1 appear to invade the developing of Clon.1 strain and causes lysis of the hyphae of the fungi. A similar study was also carried out with the fungus Trichoderma sp.. The results showed that the mycoparasitic fungus Trichoderma sp. is highly competitive against all phytopathogenic fungi and against Metarhizium sp.. However, it may coexist with B. bassiana fungi.