Ταυτοποίηση της μετάλλαξης mosaic του φυτού Arabidopsis thaliana

Abstract

Η μετάλλαξη mosaic του φυτού Arabidopsis thaliana, αποτελεί προϊόν EMS μεταλλαξιγένεσης του Εργαστηρίου Μοριακής Βιολογίας του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών. Φαινοτυπικά, το μετάλλαγμα εμφανίζει ένα ιδιόρρυθμο κλιμακούμενο πρότυπο χλώρωσης ξεκινώντας από τις κεντρικές νευρώσεις των φύλλων τις ροζέτας με σταδιακή επέκταση σε ολόκληρη την επιφάνεια του ελάσματος. O φαινότυπος mosaic οφείλεται σε υπολειπόμενη μετάλλαξη, που εντοπίζεται σε μία περιοχή 64.000bp του κάτω βραχίονα του χρωμοσώματος IV, η οποία απαρτίζεται από 14 γονίδια (At4g21380-At4g21510), σημαντικός αριθμός των οποίων εμπλέκονται άμεσα ή έμμεσα σε αμυντικούς μηχανισμούς. Παρότι η ακριβής θέση της μετάλλαξης δεν είχε έως σήμερα προσδιοριστεί, η ιδιαιτερότητα αυτή της περιοχής δημιούργησε ως επικρατέστερη ερμηνεία για τη λειτουργική δράση του υπεύθυνου γονιδίου αυτήν ενός αρνητικού ρυθμιστή στο αμυντικό μονοπάτι απόκρισης του φυτού έναντι παθογόνων μικροοργανισμών. Σκοπό της παρούσας μεταπτυχιακής μελέτης αποτέλεσε η ταυτοποίηση της μετάλλαξης mosaic. Δεδομένα ανάλυσης μικροσυστοιχιών από βάσεις δεδομένων υπέδειξαν αυξημένα επίπεδα έκφρασης τόσο στα φύλλα όσο και έναντι παραγόντων βιοτικής ή αβιοτικής καταπόνησης για έξι γονίδια προς εξέταση από την προαναφερθείσα περιοχή. Κλωνοποίηση και ανάλυση των αποτελεσμάτων αλληλούχισής τους, οδήγησε τελικά στον εντοπισμό της μετάλλαξης, ως μία splice-site mutation του γονιδίου FMN/FHY (At4g21470), που κωδικοποιεί για ένα ένζυμο με διττή δράση ως κινάση της ριβοφλαβίνης/φωσφατάση του FMN,-συστατικό του μονοπατιού βιοσύνθεσης της ριβοφλαβίνης. Η βιβλιογραφία αποδίδει στη ριβοφλαβίνη και στα παράγωγά της σημαντικό ρόλο σε αναπτυξιακές και αμυντικές διεργασίες. Η πλειοψηφία των αναφορών θεωρεί τη ριβοφλαβίνη ως επαγωγέα της άμυνας κυρίως μέσω εξωγενούς χορήγησής της, ωστόσο έρευνες μεταλλαγμάτων για γονίδια του μονοπατιού ενισχύουν αυτήν την υπόθεση παρέχοντας δεδομένα και για την επίδραση που φέρουν μεταβολές των ίδιων των ενδογενών επιπέδων της. Αξιοσημείωτη είναι η περίπτωση του μεταλλάγματος για το γονίδιο PHS1 (photosensitive 1), συστατικού του ίδιου μονοπατιού, το οποίο εμφανίζει ανάλογο πρότυπο χλώρωσης και ανάπτυξης με το mosaic, δίνοντας ιδιαίτερη έμφαση στη φωτοευαίσθητη φύση των δύο μεταλλαγμάτων. Η μελέτη του PHS1 υποδεικνύει πως αυτή η φαινοτυπική ανωμαλία οφείλεται σε φωτο-οξειδωτική καταπόνηση, γεγονός που θα μπορούσε να έχει εφαρμογή και στο mosaic. Φυσικά περαιτέρω πειραματικοί χειρισμοί χρειάζονται να πραγματοποιηθούν μελλοντικά για την τεκμηρίωση της συγκεκριμένης υπόθεσης.

Mosaic is an EMS-derived mutant of the plant Arabidopsis thaliana, created at the Molecular Biology Laboratory of the Agricultural University of Athens. Phenotypically, the mutants exhibit a peculiar chlorotic pattern starting from the central vein of the senescent leaves and gradually expanding over the entire surface of young leaves during the development of mosaic plants. Mosaic owes its phenotype to a recessive mutation which is located in a 64kbp region on the Arabidopsis chromosome IV, consisting of 14 genes (with annotation numbers At4g21380 to At4g21510), a significant number of which are engaged directly or indirectly to defense mechanisms. Although the exact position of the mutation has not been determined to date, this region being connected to immune responses has resulted to the most prevalent interpretation for the functional role of the mutated gene as a negative regulator in the plant signal transduction upon perception of pathogen attacks. The aim of the current Master thesis was the identification of the mosaic mutation. Microarray analysis data collected from online databases indicated increased levels of expression in older leaves tissues and elicitor-treated tissues for six candidate genes to be examined. Subsequently, molecular cloning and analysis of their sequencing data resulted to the identification of the mosaic mutation and its characterization as a splice-site mutation of the FMN/FHY gene, which encodes an enzyme of the riboflavin biosynthetic pathway. Current literature attributes riboflavin and its derivatives to a significant role in numerous developmental and defense processes. The majority of scientific reports refer to riboflavin as a defense elicitor but this has been mainly suggested due to its ability to induce defense responses after exogenous treatment with riboflavin. However, research into mutants for genes being part of the riboflavin biosynthesis enhance this hypothesis by providing data on the effect of the altered endogenous levels of flavins have on plant immune adaptation. Remarkably, a mutant for the PHS1 gene, a component of riboflavin biosynthesis, exhibited a similar to mosaic phenotypic pattern of chlorosis and development indicating the photosensitive nature of both mutants. The study of phs1 suggests that this phenotypic abnormality is owing to photooxidative stress, a suggestion that could be applied also to mosaic. Undoubtedly, the specific case should be experimentally validated in the future.