Ανάπτυξη, επικύρωση και εφαρμογή μεθόδου υγρής χρωματογραφίας υδρόφιλης αλληλεπίδρασης (HILIC) για τον προσδιορισμό σακχάρων σε γαλακτοκομικά προϊόντα

Abstract

Carbohydrates are essential components of human nutrition and are always listed on the nutrition labeling of foods. Sugars belong to the broader category of carbohydrates and are divided into disaccharides and monosaccharides. Lactose is the main sugar of milk while other sugars like glucose, fructose, sucrose, lactulose (due to severe thermal food processing), GOS (galactoligosaccharides) and FOS (fructoligosaccharides) are contained in the milk. Official methods (ISO, IDF, AOAC) for the simultaneous determination of monosaccharides and disaccharides in dairy products have not been developed yet. The only analytical method applied in dairy products for sugars determination is AOAC 980.13 for milk chocolate and cocoa. The purpose of the present study was the development of a Hydrophilic Interaction Liquid Chromatographic method (HILIC) using refractive index detector, for the simultaneous determination of more than one sugars in infant formulas and similar products. First the appropriate conditions for the separation of the sugars fructose, glucose, sucrose, lactose, maltose and lactulose were studied. Specifically the appropriate composition of mobile phase, its flow and the volume of sample injection were studied. Calibration curves were constructed afterwards. Additionally a series of experiments were performed on certified reference material for method validation. The repeatability and reproducibility were determined by validation experiments. Finally the proposed method was tested on foods other than dairy products. According to the results, the appropriate mobile phase was acetonitrile-water (75:25 v/v) and 0,2% (v/v) TEA as modifier with a flowrate of 1mL/min and injection volume of 10 μL. Lactose was the only sugar detected in the infant formula under study successfully quantified. Its recovery reached 84% while method’s repeatability was adequate. The experiments were repeated successfully in certified reference material where recovery was found to be 91.2%. Subsequently, the method validation experiments showed good recovery especially for lactose (87.01% - 104.73%) which is the major sugar of the infant formula, whereas for all sugars the reproducibility was very good (S.E. <12%). The limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) were at satisfactory levels (LOD: 0,05 – 0,08 g/L and LOQ: 0,14 - 0,24 g/L). Finally, the proposed method was also tested on cereal-based infant foods with satisfactory recovery and reproducibility. These results provided positive evidence for the use of the method in other food categories beyond dairy products.

Οι υδατάνθρακες αποτελούν βασικά συστατικά της διατροφής του ανθρώπου, περιέχονται σε όλα τα τρόφιμα και αναγράφονται πάντα στην ετικέτα διατροφικής επισήμανσης των τροφίμων. Τα σάκχαρα ανήκουν στην ευρύτερη κατηγορία των υδατανθράκων και διακρίνονται σε δισακχαρίτες και μονοσακχαρίτες. Το κυρίαρχο σάκχαρο του γάλακτος είναι η λακτόζη, ενώ σε πολλά γαλακτοκομικά προϊόντα απαντώνται συνήθως γλυκόζη, φρουκτόζη, σακχαρόζη, λακτουλόζη (λόγω θερμικής επεξεργασίας) και διάφοροι γαλακτοολιγοσακχαρίτες (GOS) και φρουκτοολιγοσακχαρίτες (FOS). Μέχρι σήμερα, δεν έχουν αναπτυχθεί επίσημες μέθοδοι (π.χ. ISO, IDF, AOAC) για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό μονο- και δισακχαριτών σε γαλακτοκομικά προϊόντα με χρωματογραφία υδρόφιλης αλληλεπίδρασης, ενώ μόνο μία μέθοδος (AOAC 980.13) περιγράφει τον προσδιορισμό διαφόρων σακχάρων σε σοκολάτα γάλακτος και κακάο. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η ανάπτυξη μιας υγροχρωματογραφικής μεθόδου υδρόφιλης αλληλεπίδρασης (HILIC) με ανιχνευτή δείκτη διάθλασης για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό διαφόρων σακχάρων που απαντώνται σε γαλακτοκομικά προϊόντα και πιο συγκεκριμένα σε βρεφικές φόρμουλες, για λόγους διατροφικής επισήμανσης. Για την επίτευξη του σκοπού αυτού αρχικά μελετήθηκαν οι κατάλληλες συνθήκες στις οποίες επιτυγχάνεται o διαχωρισμός των σακχάρων γλυκόζη, φρουκτόζη, σακχαρόζη, λακτόζη, μαλτόζη και λακτουλόζη. Πιο συγκεκριμένα μελετήθηκε η κατάλληλη επιλογή κινητής φάσης, η ροή αυτής και o όγκος έγχυσης του δείγματος στο σύστημα. Τον προσδιορισμό των κατάλληλων συνθηκών ακολούθησε η κατασκευή της πρότυπης καμπύλης κάθε σακχάρου. Πραγματοποιήθηκαν σειρές πειραμάτων για τον προσδιορισμό του είδους των σακχάρων στο βρεφικό γάλα υπό μορφή σκόνης και ακολούθησε η ποσοτικοποίηση τους. Ταυτόχρονα σειρές πειραμάτων πραγματοποιήθηκαν και σε πιστοποιημένο υλικό αναφοράς για την επαλήθευση της αποτελεσματικότητας της μεθόδου. Η επαναληψιμότητα και η αναπαραγωγιμότητα της μεθόδου ελέγχθηκαν μέσω πειραμάτων επικύρωσης. Τελικώς η μέθοδος δοκιμάστηκε και σε άλλης κατηγορίας τρόφιμα πέραν των γαλακτοκομικών προϊόντων. Τα πειράματα έδειξαν πως η μέθοδος λειτουργεί ικανοποιητικά με τη χρήση κινητής φάσης ακετονιτριλίου-νερού (75:25 v/v) και 0,2% (v/v) τριαιθυλαμίνη ως τροποποιητής με ροή 1mL/min και όγκο έγχυσης δείγματος τα 10 μL. Στο βρεφικό γάλα υπό μορφής σκόνης ανιχνεύθηκε μόνο λακτόζη, η οποία ποσοτικοποιήθηκε επιτυχώς με τη βοήθεια πρότυπης καμπύλης. Ταυτόχρονα μελετήθηκε και η ανάκτηση της λακτόζης, η μέση τιμή της οποίας ήταν 84%, ενώ η επαναληψιμότητα της μεθόδου ήταν πολύ καλή. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν με επιτυχία και σε πιστοποιημένο υλικό αναφοράς όπου η ανάκτηση βρέθηκε ίση με 91,2%. Σε συνέχεια αυτών, τα πειράματα επικύρωσης της μεθόδου έδειξαν καλή ανάκτηση ειδικά για τη λακτόζη (87,01% - 104,73%) που είναι το κύριο σάκχαρο της βρεφικής φόρμουλας ενώ για όλα τα σάκχαρα η επαναληψιμότητα ήταν πολύ καλή (S.E. <12%). Τα όρια ανίχνευσης (LOD) και ποσοτικοποίησης (LOQ) κυμάνθηκαν σε ικανοποιητικά επίπεδα (LOD: 0,05 – 0,08 g/L και LOQ: 0,14 - 0,24 g/L). Τέλος η προτεινόμενη μέθοδος δοκιμάστηκε και σε βρεφικές τροφές με βάση τα δημητριακά με ικανοποιητικά αποτελέσματα ανάκτησης και επαναληψιμότητας, δίνοντας θετικά στοιχεία για χρήση της μεθόδου και σε άλλες κατηγορίες τροφίμων πέραν των γαλακτοκομικών προϊόντων.