Η μεταβολομική ανάλυση των υδρόφιλων μεταβολιτών του κελυφωτού φιστικιού (Pistacia vera L.) ως εργαλείο ελέγχου της γεωγραφικής του προέλευσης

Abstract

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η γεωγραφική διαφοροποίηση του φιστικιού Αιγίνης, σε σχέση με τα κελυφωτά φιστίκια (Pistacia vera L.) που παράγονται σε άλλες περιοχές της Ελλάδας. Ελήφθησαν αποξηραμένα κελυφωτά φιστίκια από την Αίγινα, την Φθιώτιδα, τα Μέγαρα και την Εύβοια. Αρχικά, έγινε προετοιμασία των δειγμάτων με υγρό άζωτο και πραγματοποιήθηκε άλεση. Ακολούθησε η εκχύλιση των υδρόφιλων μεταβολιτών με χρήση μίγματος οργανικών διαλυτών, σύμφωνα με τροποποιημένη μέθοδο Bligh-Dyer. Έπειτα, ακολούθησε λυοφιλίωση του εκχυλίσματος και σιλυλίωση των υδρόφιλων μεταβολιτών. Τέλος, τα παράγωγα των υδρόφιλων μεταβολιτών προσδιορίστηκαν με αέρια χρωματογραφία-φασματομετρία μαζών (GC-MS). Επιπλέον, κατασκευάστηκε βάση δεδομένων φασματομετρίας μαζών και δεικτών κατακράτησης πρότυπων ενώσεων από το εύρος των μεταβολιτών που αναμενόταν να ανιχνευθούν στα δείγματα (σάκχαρα, αμινοξέα, οργανικά οξέα, κτλ). Ακολούθως, τα δεδομένα της φασματομετρίας μαζών επεξεργάστηκαν μέσω των λογισμικών GCMS-Solution, AMDIS και MS-DIAL, προκειμένου να προκύψει μία μήτρα δεδομένων κατάλληλη για στατιστική επεξεργασία με μεθόδους πολυμεταβλητής ανάλυσης με χρήση της διαδικτυακής πλατφόρμας MetaboAnalyst. Αρχικά, τα αποτέλεσματα της ανάλυσης των κυρίων συνιστωσών (PCA), καθώς και της μεθόδου των μερικών ελαχίστων τετραγώνων διακριτικής ανάλυσης (PLS-DA), δεν ήταν ικανοποιητικά, καθώς τα δείγματα των διαφορετικών περιοχών δεν διαχωρίζονταν επαρκώς. Για τον λόγο αυτό τα δείγματα χωρίστηκαν σε δύο κατηγορίες, South (Νότια) και North (Βόρεια). Αξίζει να σημειωθεί ότι η ομάδα South αποτελούνταν μόνο από τα δείγματα φιστικιού Αιγίνης. Έτσι, η μέθοδος της ανάλυσης των κυρίων συνιστωσών (PCA), έδωσε πολύ καλύτερο διαχωρισμό των δειγμάτων, ενώ η μέθοδος των μερικών ελαχίστων τετραγώνων διακριτικής ανάλυσης (PLS-DA), διαχώρισε τα δείγματα αλλά η επικύρωση του μοντέλου δεν ήταν ικανοποιητική. Οι μεταβολίτες που εντοπίστηκαν από τα παραπάνω αποτελέσματα, καθώς και από τα t-tests, ως οι πιο σημαντικοί για την διάκριση των δειγμάτων σε South (Νότια) και North (Βόρεια) χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω στατιστική ανάλυση. Μερικοί από τους μεταβολίτες αυτούς ήταν η τρεαλόζη, γαλακτινόλη, ινοσιτόλη, διάφορα αμινοξέα (γλυκίνη, τυροσίνη, θρεονίνη, αλανίνη, βαλίνη, λευκίνη), ηλεκτρικό οξύ, μαλτόζη, κ.α. Εφαρμόστηκαν εκ νέου διάφορες μέθοδοι πολυμεταβλητής ανάλυσης (PCA, PLS-DA, OPLS-DA, HCA, K-means clustering), βάσει των οποίων προέκυψε πολύ καλή διαφοροποίηση των δειγμάτων από τις περιοχές North-South. Επιπρόσθετα, τα μοντέλα επικυρώθηκαν μέσω δοκιμών μεταστοιχείωσης. Συμπερασματικά, η μεταβολωμική με χρήση GC-MS, φαίνεται ότι μπορεί να αποτελέσει ένα χρήσιμο εργαλείο για την διάκριση της γεωγραφικής προέλευσης των κελυφωτών φυστικιών. Ωστόσο, λόγω του σχετικά μικρού αριθμού δειγμάτων που εξετάστηκαν, κρίνεται σκόπιμο να διερευνηθεί περαιτέρω η προτεινομένη μεθοδολογία με χρήση μεγαλύτερου αριθμού δειγμάτων από περισσότερες περιοχές της Ελλάδος ή/και άλλων χωρών.

The purpose of the present study was to differentiate pistachio nuts (Pistacia vera L.) produced in various regions of Greece. Dried peanuts were obtained from Aegina, Fthiotida, Megara and Euboea. Initially, the samples were milled using liquid nitrogen. The hydrophilic polar metabolites were extracted using a mixture of organic solvents according to a modified Bligh-Dyer method. The extract was lyophilized and subsequently the silylated derivatives of the metabolites were produced and determined using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). In addition, a mass spectrometry database and retention indices of model compounds were constructed from the range of metabolites expected to be detected in the samples (sugars, amino acids, organic acids, etc.). Subsequently, the raw mass spectral data were processed using GCMS-Solution, AMDIS and MS-DIAL software, to obtain a data matrix suitable for statistical processing by multivariate analysis methods using the MetaboAnalyst online platform. Initially, the results of principal component analysis (PCA) and partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) were not satisfactory as the samples from the different regions were insufficiently separated. For this reason, the samples were divided into two categories, South and North. It is worth noting that the South group consisted only of pistachios from Aegina region. Thus, PCA gave much better sample separation, while the PLS-DA method separated the samples but the validation of the model was not satisfactory. Thus, the most statistically important metabolites identified by the aforementioned methods, as well as by t-tests, were used for further statistical analysis. Some of these metabolites were trehalose, galactinol, inositol, various amino acids (glycine, tyrosine, threonine, alanine, valine, leucine), succinic acid, maltose, etc. Various multivariate analysis methods were re-applied (PCA, PLS-DA, OPLS-DA, HCA, K-means clustering), which presented very good differentiation of the samples from the North and South regions. In addition, the models were validated by permutation tests. In conclusion, GC-MS metabolomics seems to be a useful tool for distinguishing the geographical origin of pistachio. However, due to the relatively small number of samples examined, it is appropriate to further investigate the proposed methodology using a larger number of samples from more regions of Greece and / or other countries.