Μελέτη των ιδιοτήτων που προάγουν την ανάπτυξη των φυτών σε βακτήρια που απομονώθηκαν από φυμάτια μαυρομάτικου φασολιού

Abstract

Τα ριζόβια είναι υπεύθυνα για τη δημιουργία φυματίων και για την αζωτοδέσμευση στα περισσότερα είδη ψυχανθών. Ωστόσο, τα φυμάτια αποικίζονται και από άλλα ριζοβακτήρια, τα οποία δεν έχουν την ικανότητα να σχηματίζουν φυμάτια. Πρόσφατες έρευνες έχουν δείξει ότι τα ριζοβακτήρια των φυματίων παρουσιάζουν μεγάλη ποικιλομορφία, συμπεριλαμβάνοντας περίπου το 99 % του συνολικού βακτηριακού πληθυσμού. Όλο και περισσότερες μελέτες υποδεικνύουν την ικανότητα ορισμένων ριζοβακτηρίων να ενισχύουν την ανάπτυξη των ψυχανθών μέσω της αζωτοδέσμευσης, της διαλυτοποίησης φωσφόρου, της ενίσχυσης της ικανότητας των συμβιωτικών ριζοβίων να δημιουργούν φυμάτια και να αζωτοδεσμεύουν. Από την άλλη πλευρά, ορισμένα μη-ριζόβια βακτήρια μπορεί να λειτουργούν αρνητικά, μειώνοντας την απόδοση των ριζοβακτηρίων ή πυροδοτώντας τους μηχανισμούς άμυνας του φυτού, οι οποίοι αποτρέπουν την αποίκιση του ξενιστή από το βακτήριο. Παρ’ όλα αυτά, η βιολογική συμβολή και οι αγρονομικές συνέπειες του ενδοφυτισμού στα φυμάτια, τελούν υπό διερεύνηση. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι ο προσδιορισμός της ποικιλομορφίας των βακτηρίων που αποικίζουν τα ριζικά φυμάτια φυτών μαυρομάτικου φασολιού, τα οποία έχουν συλλεχθεί από διαφορετικές περιοχές της Ελλάδας, καθώς και η μελέτη της ικανότητάς τους να προάγουν την ανάπτυξη των φυτών, ώστε να επιλεγούν εκείνα με την υψηλότερη απόδοση, τα οποία θα μπορούσαν μελλοντικά να χρησιμοποιηθούν ως βιολιπάσματα. Ενδοφυτικά βακτήρια απομονώθηκαν από φυμάτια καλλιεργούμενου μαυρομάτικου φασολιού και ταξινομήθηκαν σε τέσσερις διαφορετικούς κλάδους (clusters), έπειτα από τη διενέργεια BOX-PCR. Στη συνέχεια, τα αντιπροσωπευτικά στελέχη από κάθε κλάδο εξετάστηκαν για την παρουσία χαρακτηριστικών που προάγουν την ανάπτυξη των φυτών και μελετήθηκε η φυλογενετική τους συγγένεια με την εφαρμογή ανάλυσης πολυτοπικής αλληλούχισης (Multilocus Sequence Analysis, MLSA) για τέσσερα γονίδια κυτταρικής επιμέλειας (gyrB, rpoB, atpD και infB). Η φυλογενετική ανάλυση έδειξε ότι οι εξεταζόμενοι μικροοργανισμοί παρουσιάζουν συγγένεια με τα στελέχη Enterobacter cloacae, Enterobacter ludwigii, Enterobacter mori και Lelliottia amnigena και πιθανά να συνιστούν νέα είδη ή υποείδη. Όλα τα υπό μελέτη στελέχη παρουσίασαν ποικίλα PGP χαρακτηριστικά in vitro: διαλυτοποίηση φωσφόρου, αζωτοδέσμευση, παραγωγή ινδολοξικού οξέος (ΙΑΑ) και σιδηροφόρων. Επιπλέον, παρουσίασαν υψηλή αντοχή στην αλατότητα (έως και 8 %). Τα παραπάνω αποτελέσματα συμβαδίζουν με ευρήματα προηγούμενων ερευνών, οι οποίες αναφέρουν ότι αρκετά στελέχη Enterobacter spp. παρουσιάζουν ποικιλία PGP χαρακτηριστικών. Τα στελέχη που εξετάστηκαν στην παρούσα μελέτη θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν μελλοντικά, για τη δημιουργία ενός φιλικού προς το περιβάλλον βιολιπάσματος για το μαυρομάτικο φασόλι και πιθανότατα και για άλλα σημαντικά είδη φυτών.

Rhizobia are responsible for root nodulation and nitrogen fixation in most legume species. However, legume nodules are occupied by other endophytic bacteria, called non-rhizobial bacteria. Recent studies have shown that a high diversity of non-rhizobial bacteria exist with nodules and they may encompass up to 99% of the total bacterial population. Growing evidence indicates that some of these non-rhizobial bacteria could be beneficial to their legume hosts by enhancing plant growth, fixing atmospheric nitrogen, solubilizing phosphate and improving the nodulation and N2 fixation of legume–rhizobia symbionts. In contrast to these positive effects, some non-rhizobial bacteria may be able to reduce the fitness of nodulating rhizobia or to trigger host defense responses resulting in the prevention of the infection process. Nevertheless, the biological significance and the agronomic implications of nodule endophytism are still not well understood. This study aimed to characterize the diversity of bacteria associated with root-nodules of cowpea plants collected from different locations in Greece and to assess their ability for promoting plant growth in order to select potential PGPR that perform higher plant growth promotion for use as biofertilizers. Nodule endophytic bacteria were isolated from field grown cowpea plants and were grouped into four clusters by BOX-PCR. Representative isolates of each cluster were subjected to multilocus sequence analysis (MLSA) using four housekeeping genes (gyrB, rpoB, atpD and infB genes) to assess their phylogenetic affiliation and were screened for various plant growth promoting traits. Phylogenetic analysis showed that the nodule endophytic isolates were related to Enterobacter cloacae, Enterobacter ludwigii, Enterobacter mori, and Lelliottia amnigena and they may constitute novel species or subspecies. All the test isolates possessed multiple plant-growth promoting characteristics in vitro: phosphate solubilization, nitrogen fixation, production of phytohormone indole acetic acid and siderophores. Moreover, the isolates exhibited high salt tolerance (up to 8%). The results are in line with previous studies reported that certain Enterobacter spp. possess multiple growth promoting activities. These isolates could be developed as an eco-friendly biofertilizer for cowpea and probably for other important plant species in future.