Μεταβολή εντερικού περιεχομένου σε ζωικό μοντέλο μυών έπειτα από χορήγηση του προβιοτικού στελέχους Lactobacillus fermentum ACA-DC 179 και μελέτη της δυνητικής αντιφλεγμονώδους δράσης του στη δημιουργία αθηρωματικών πλακών

Abstract

To αντικείμενο της παρούσας εργασίας ήταν η χορήγηση του προβιοτικού στελέχους Lactobacillus fermentum ACA-DC 179 σε ζωικό μοντέλο μυών με σκοπό τη μελέτη των μεταβολών της εντερικής μικροχλωρίδας, καθώς και την αντιφλεγμονώδη δράση του σε κατάσταση ήπιας αθηρωμάτωσης. Υλικά και μέθοδοι: Στα αρχικά πειράματα, πραγματοποιήθηκε ταυτοποίηση και τυποποίηση του προβιοτικού στελέχους με τη χρήση μιας φαινοτυπικής και δύο μοριακών μεθόδων [ζύμωση υδατανθράκων (ΑPI test), species-specific PCR και RAPD-PCR], χρησιμοποιώντας για το σκοπό αυτό και άλλα δύο στελέχη της συλλογής του Εργαστηρίου Γαλακτοκομίας του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών (L. fermentum ΑCA-DC 2882, και L. fermentum ΑCA-DC 4010Τ). Επίσης, μελετήθηκε η επιβίωση και η σταθερότητα ανάπτυξης του L. fermentum ACA-DC 179 σε συνθήκες ψύξης (4ο C). Για την in vivo μελέτη χρησιμοποιήθηκε πληθυσμός Apoliprotein Ε knockout μυών, ένα ζωικό μοντέλο που αναπτύσσει ήπια αθηροσκλήρωση. Εξήντα (60) μύες C57B/6 ηλικίας 12 εβδομάδων τυχαιοποιήθηκαν σε έξι (6) ομάδες των 8-10 ατόμων η καθεμία (n= 8-10). Η 1η ομάδα περιελάμβανε αρσενικά ζώα που διατρέφονταν με τυπική δίαιτα (normal chow diet) και λάμβαναν παράλληλα χαμηλή δόση του μικροοργανισμού (106 CFU/ημέρα), η 2η αρσενικά ζώα που διατρέφονταν με τυπική δίαιτα και τους χορηγούνταν παράλληλα ο μικροοργανισμός σε υψηλή δόση (109 CFU/ημέρα), η 3η θηλυκά ζώα που διατρέφονταν με τυπική δίαιτα και λάμβαναν παράλληλα χαμηλή δόση του μικροοργανισμού (106 CFU/ημέρα), η 4η θηλυκά ζώα που διατρέφονταν με τυπική δίαιτα και λάμβαναν παράλληλα τον μικροργανισμό σε υψηλή δόση (109 CFU/ημέρα), η 5η ομάδα αρσενικά ζώα που διατρέφονταν με τυπική δίαιτα (control group 1), χωρίς να λαμβάνουν τον μικροοργανισμό και η 6η θηλυκά ζώα που διατρέφονταν με τυπική δίαιτα (control group 2) χωρίς να λαμβάνουν τον μικροοργανισμό. Το βάρος και η φυσική κατάσταση των ζώων εξετάζονταν μία φορά εβδομαδιαίως. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση της μικροβιακής χλωρίδας του εντέρου για οκτώ ομάδες μικροοργανισμών (Total aerobes, Total anaerobes, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Enterococcus spp Total coliforms, Staphylococcus & Micrococcus spp, Clostridium spp) και συγκεκριμένα αναλύσεις κοπράνων ανά ομάδα ζώων σε 3 χρονικά σημεἰα (0 days- 30 days- 60 days) και αναλύσεις εντερικών περιεχομένων ανά ζώο στις 60 days σε δείγματα από λεπτό έντερο, τυφλό και κόλον. Πραγματοποιήθηκαν επίσης βιοχημικές αναλύσεις στον ορό του αίματος που λήφθηκε από τα ζώα κατά τη ευθανασία, όπου μελετήθηκαν οι εξής βιοχημικές παράμετροι: γλυκόζη, τριγλυκερίδια, ολική χοληστερόλη, λιποπρωτεΐνη υψηλής πυκνότητας, λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας και το ένζυμο του ήπατος γ-γλουταμυλοτρανσφεράση. Επίσης, πραγματοποιήθηκαν ιστολογικές αναλύσεις σε δείγματα αορτικού τόξου και αορτικής βαλβίδας που λήφθηκαν από τα ζώα κατά την ευθανασία και τα οποία βάφτηκαν με τη χρώση αιματοξυλίνης/εωσίνης για τον εντοπισμό και αναγνώριση των αθηρωματικών αλλοιώσεων. Αποτελέσματα: Οι μεταβολές στη μικροβιακή χλωρίδα του εντέρου δεν ήταν τόσο ευδιάκριτες μετά τη χορήγηση του προβοτικού στελέχους. Παρατηρήθηκε αύξηση στον πληθυσμό των γαλακτοβακίλλων και των bifidobacteria και μείωση στο πληθυσμό των εντεροκόκκων σε αρσενικά και θηλυκά ζώα που λάμβαναν την υψηλή δόση σε σχέση με τα control. Όσον αφορά στις ιστολογικές μεταβολές παρατηρήθηκε ελαφρά αισθητή διαφορά στο πάχος της αθηρωματικής πλάκας σε βαλβίδα και αορτή μεταξύ των control ζώων και εκείνων που λάνβαναν τη υψηλή δόση του μ/ο. Αναφορικά με το βιοχημικό προφίλ των ζώων παρατηρηθήκε ενδεικτική αλλά ικανοποιητική εικόνα της μείωσης των βιοδεικτών που σχετίζονται με την αθηροσκλήρωση μετά τη χορήγηση του προβιοτικού για 60 ημέρες (μείωση ολικής CHOL και TG σε θηλυκά και TG σε αρσενικά ζώα). Συμπεράσματα: Η μελέτη των προβιοτικών μικροοργανισμών καταδεικνύει τα σημαντικά οφέλη τους στους ξενιστές μέσω των μηχανισμών δράσης τους, μεταξύ των οποίων πολύ σημαντική αποδεικνύεται η τροποποίηση της εντερικής μικροχλωρίδας, όπως κατέδειξε και η χορήγηση του L. fermentum ACA-DC 179. H χορήγηση του L. fermentum ACA-DC 179 προκάλεσε ιστολογικές μεταβολές, ελαφρά αισθητές σε ζώα που λάμβαναν την υψηλή δόση του μ/ο τα οποία δεν παρουσίασαν αθηρωματικές πλάκες σε σχέση με τα ζώα που λάμβαναν τη χαμηλή δόση του μ/ο και τα control ζώα τα οποία εμφάνισαν αθηρωματικές πλάκες σε βαλβίδα και αορτή, η οποία καταδεικνύει μἰα ενδεικτική αντιαθηρωματική δράση του προβιοτικού στελέχους. Το βιοχημικό προφίλ των ζώων έδειξε ότι η χορήγηση του μ/ο μειώνει τους βιοχημικούς δείκτες που σχετίζονται με την αθηροσκλήρωση μετά τη χορήγηση του προβιοτικού στελέχους για 60 ημέρες, με χαρακτηριστική τη μείωση της ολικής CHOL και TG σε θηλυκά και TG σε αρσενικά ζώα που λάμβαναν την υψηλή δὀση του μ/ο σε σχέση με τα ζώα που λάμβαναν τη χαμηλή δόση του μ/ο και τα control ζώα.

The aim of the present study was to administer the probiotic strain Lactobacillus fermentum ACA-DC 179 to an animal model of mice in order to study changes in the intestinal microflora and its anti-inflammatory effect in mild atherosclerosis. Materials and methods: In the initial experiments, the probiotic strain was identified and standardized using a phenotypic and two molecular methods [carbohydrate fermentation (API test), species-specific PCR and RAPD-PCR], using two more strains of the Dairy Collection of Agricultural University of Athens (L. fermentum ACA-DC 2882, and L. fermentum ACA-DC 4010T). The survival and growth stability of L. fermentum ACA-DC 179 under cooling conditions (4ο C) were also studied. For the in vivo study we used a population of Apoliprotein E knockout mice, an animal model that develops mild atherosclerosis. Sixty (60) 12-week-old C57B / 6 mice were randomized to six (6) groups of 8-10 individuals each (n = 8-10). The first group consisted of animals fed with normal chow diet and received a low dose of microorganism (106 CFU / day), the second group of male animals fed with normal chow diet and received a high dose of microorganism (109 high-dose CFU / day), the third of female animals fed with normal chow diet and received a low dose of microorganism (106 CFU / day), the forth of female animals fed with normal chow diet and received the high dose microorganism (109 CFU / day) ), the fifth group of male animals fed with normal chow diet (control group 1), without taking the microorganism and the sixth of female animals fed with normal chow diet (control group 2) without receiving the microorganism. The weight and physical condition of the animals were examined once a week. Microbial intestinal flora was analyzed for eight groups of microorganisms (Total aerobes, Total anaerobes, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Enterococcus spp, Total coliforms, Staphylococcus & Micrococcus spp., Clostridium spp in the feces at three different time points ( 0 days- 30 days- 60 days) and in the intestinal contents per animal at 60 days in samples of small intestine, cecum and colon. Biochemical analyses of blood serum obtained from all animals during euthanasia were also performed and the following biochemical parameters were studied: glucose, triglycerides, total cholesterol, high density lipoprotein, low density lipoprotein and γ-glutamyltransferase. Histological analyses were also performed on aortic arch and aortic valve specimens obtained from animals at euthanasia stained with hematoxylin/ eosin in order to identify atherosclerotic lesions Results: Changes in microbial intestinal flora were not as prominent after administration of the probiotic strain. There was an increase in the population of lactobacilli and bifidobacteria and a decrease in the population of enterococci in male and female animals receiving the high dose compared to controls. Regarding histological changes, a slight difference in the thickness of the atherosclerotic plaque and aorta was observed between the control animals and those receiving the high dose. Regarding the biochemical profile of the animals, there was a satisfactory reduction in biomarkers associated with atherosclerosis after administration of the probiotic for 60 days (reduction in total CHOL and TG in females and TG in males). Conclusions: The study of probiotic microorganisms demonstrates their significant benefits to the hosts through their mechanisms of action, including the modification of the intestinal microflora, which has been shown to be very important, something that was shown by the administration of L. fermentum ACA-DC 179. Administration of L. fermentum ACA-DC 179 induced histologic changes to animals receiving high-dose. These animals did not have atherosclerotic plaques compared to animals receiving low-dose and controls, which exhibited atherosclerotic plaques on the valve and aorta,.This demonstrates an anti-inflammatory effect in mild atherosclerosis of the probiotic strain. The biochemical profile of the animals showed that the administration of L. fermentum ACA-DC 179 reduces the biochemical markers associated with atherosclerosis after the administration of the probiotic strain for 60 days, with a significant decrease in total CHOL and TG in females and TG in male animals. the high dose of the animal compared to the animals receiving the low dose and the control animals. Key words: Lactobacillus fermentum ACA-DC 179, gut microbiota, atherosclerosis, inflammation.