Μελέτη της βιοτεχνολογικής παραγωγής 2,3- βουτανοδιόλης κατά την αύξηση επιλεγμένων βακτηριακών στελεχών σε σακχαρούχα ανανεώσιμα υποστρώματα

Abstract

Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της αξιοποίησης άγριων βακτηριακών στελεχών, απομονωμένων από διάφορα είδη τροφίμων και δυνητικώς μη-παθογόνων, σχετικά με τη χρήση τους ως μικροβιακά κυτταρικά εργαστήρια, για την παραγωγή 2,3-βουτανοδιόλης και ακετοΐνης. Η παραγωγή των δύο αυτών μεταβολιτών παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον καθώς τα προϊόντα αυτά βρίσκουν πολυάριθμες εφαρμογές στη βιομηχανία μελανιών, αρωμάτων, πλαστικών, στη βιομηχανία των τροφίμων αλλά και στην φαρμακοβιομηχανία. Πολλοί μονοσακχαρίτες αλλά και βιομηχανικά απόβλητα πλούσια σε σάκχαρα, μετατρέπονται σε 2,3-βουτανοδιόλη και το παράγωγό αυτής, την ακετοΐνη, με τη χρήση μικροοργανισμών, μέσω του βιοσυνθετικού μονοπατιού παραγωγής 2,3-βουτανοδιόλης - οργανικών οξέων. Στο πρώτο μέρος της παρούσας έρευνας, μελετήθηκε η ικανότητα εννέα άγριων βακτηριακών στελεχών που απομονώθηκαν από τρόφιμα, να αφομοιώνουν τη γλυκόζη και τη σακχαρόζη προς παραγωγή 2,3-βουτανοδιόλης και ακετοΐνης. Τα στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα Enterobacter ludwigii FMCC-204, Enterobacter aerogenes FMCC-9, Enterobacter aerogenes FMCC-10, Citrobacter freundii FMCC-207, Klebsiella oxytoca FMCC-197, Enterobacter sp. FMCC-208, Citrobacter freundii FMCC-8, Citrobacter farmeri FMCC-5 και Citrobacter farmeri FMCC-7. Οι παραπάνω μικροοργανισμοί καλλιεργήθηκαν σε κλειστού τύπου ζυμώσεις οι οποίες πραγματοποιήθηκαν σε φιάλες Duran στους 30 °C. Πέραν των τριών τελευταίων στελεχών, τα υπόλοιπα έξι έδωσαν ικανοποιητικά αποτελέσματα αφού ήταν ικανά να καταναλώσουν τόσο τη γλυκόζη όσο και τη σακχαρόζη προς παραγωγή 2,3-βουτανοδιόλης. Από τα ειρημένα στελέχη, δύο, ήτοι τα K. oxytoca FMCC-197 και Enterobacter sp. FMCC-208, επελέγησαν για περαιτέρω έρευνα, αφού συνδύασαν ικανοποιητική απόδοση και παραγωγικότητα κατά την αύξησή τους και στις δύο πηγές ανωτέρω άνθρακα. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, μελετήθηκε ο τρόπος επίδρασης διαφορετικών παραγόντων στην αύξηση του στελέχους K. oxytoca FMCC-197 αλλά και στην παραγωγή 2,3-βουτανοδιόλης και ακετοΐνης. Έτσι, μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας αλλά και της αρχικής συγκέντρωσης του υποστρώματος στην αύξηση του μικροοργανισμού και την τελική συγκέντρωση προϊόντος. Πιο συγκεκριμένα, το ανωτέρω στέλεχος έδωσε ιδιαίτερα ικανοποιητικά αποτελέσματα σε ένα μεγάλο εύρος θερμοκρασιών κατά τη διάρκεια αερόβιων καλλιεργειών σε κωνικές φιάλες, χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα τη σακχαρόζη, ενώ σε θερμοκρασίες μεγαλύτερες από τους 37 °C, η τελική απόδοση προϊόντος αλλά και η παραγωγικότητα μειώθηκαν αισθητά. Σε μία επόμενη σειρά πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις σακχαρόζης και το στέλεχος K. oxytoca FMCC-197 έδειξε ιδιαίτερη ικανότητα να αναπτύσσεται ακόμα και σε συγκεντρώσεις υψηλότερες των 90 g l-1. Ωστόσο, σε συγκεντρώσεις σακχάρου μεγαλύτερες των 120 g l-1, παρατηρήθηκε το φαινόμενο της παρεμπόδισης εκ του υποστρώματος, με μειωμένη απόδοση παραγωγής και μη-αμελητέο μέρος του υποστρώματος να παραμένει ακατανάλωτο κατά το τέλος της διεργασίας. Η μελέτη του συγκεκριμένου στελέχους συνεχίστηκε με την καλλιέργειά του σε διαφορετικές πηγές άνθρακα. Έτσι σε μία σειρά αερόβιων ζυμώσεων σε κωνικές φιάλες χρησιμοποιήθηκαν οι εξής πηγές άνθρακα: γλυκόζη, φρουκτόζη, μαννόζη, ξυλόζη, αραβινόζη, γαλακτόζη, σακχαρόζη και μελάσα. Τα αποτελέσματα των ζυμώσεων ήταν εξίσου ικανοποιητικά, αφού καταναλώθηκαν όλες οι πηγές άνθρακα αποδεικνύοντας ότι το στέλεχος Κ. oxytoca FMCC-197 μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε μεγάλη κλίμακα για τη βιομετατροπή αποβλήτων πλούσιων στις παραπάνω πηγές άνθρακα προς 2,3-βουτανοδιόλη και ακετοΐνη. Επίσης κατά τη διάρκεια αναερόβιων και αερόβιων καλλιεργειών αξιολογήθηκε η ικανότητα αποχρωματισμού της μελάσας, όπου ξεπέρασε το 40% και στις δυο περιπτώσεις, χωρίς η μελέτη της διεργασίας του αποχρωματισμού να υφίσταται περαιτέρω αριστοποίηση. Αξιολογώντας τα αποτελέσματα των παραπάνω ζυμώσεων και με στόχο την αύξηση της τελικής συγκέντρωσης του προϊόντος, πραγματοποιήθηκαν ημι-συνεχείς τροφοδοτούμενες καλλιέργειες σε βιοαντιδραστήρα κάτω από διαφορετικές συνθήκες ζύμωσης. Οι δύο πρώτες ημι-συνεχείς τροφοδοτούμενες καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν στους 30 °C κάτω από αναερόβιες ή αερόβιες συνθήκες, χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα μίγμα μελάσας και εμπορικής σακχαρόζης. Τω όντι, η συγκέντρωση του τελικού προϊόντος αυξήθηκε πάρα πολύ στις αερόβιες συνθήκες οι οποίες είχαν επιβληθεί, όπου παρήχθησαν 101.1 g l-1 2,3-βουτανοδιόλης και 14.2 g l-1 ακετοΐνης. Οι τιμές αυτές είναι από τις πλέον ικανοποιητικές της διεθνούς βιβλιογραφίας στο εν λόγω επιστημονικό θέμα και για άγρια (μη-γενετικώς τροποποιημένα) βακτηριακά στελέχη χρησιμοποιούμενα ως κυτταρικά εργαστήρια. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ημι-συνεχής τροφοδοτούμενη καλλιέργεια σε βιοαντιδραστήρα στους 37 °C χρησιμοποιώντας μελάσα και σακχαρόζη ως πηγή άνθρακα, έτσι ώστε τα αποτελέσματα να συγκριθούν με τα αντίστοιχα που επετεύχθησαν στους 30 °C. Παρά το γεγονός ότι παρατηρήθηκε μικρή διαφορά στην τελική απόδοση, η παραγωγικότητα ήταν σημαντικά χαμηλότερη στους 37 °C. Τέλος, πραγματοποιήθηκε ημι-συνεχής τροφοδοτούμενη καλλιέργεια σε βιοαντιδραστήρα στους 30 °C χρησιμοποιώντας τη μελάσα ως τη μοναδική πηγή άνθρακα έτσι ώστε να μελετηθεί τυχόν παρεμπόδιση λόγω υποστρώματος, με την τελική συγκέντρωση προϊόντος και την παραγωγικότητα να είναι σημαντικά χαμηλότερες. Περαιτέρω υπήρξε ενδιαφέρον σχετικά με την πραγματοποίηση ζυμώσεων σε μη προηγουμένως αποστειρωθέν υπόστρωμα, γι’ αυτό πραγματοποιήθηκαν δυο ημι-συνεχείς τροφοδοτούμενες ζυμώσεις σε κωνικές φιάλες, χρησιμοποιώντας στην πρώτη περίπτωση αποστειρωμένο θρεπτικό μέσο και στη δεύτερη περίπτωση μέσο που είχε υποστεί προηγούμενη παστερίωση. Η τελική παραγωγή προϊόντος ήταν ικανοποιητική ακόμα και στην περίπτωση τους προηγουμένως παστεριωμένου θρεπτικού μέσου. Στο τρίτο μέρος της διδακτορικής διατριβής, πραγματοποιήθηκε αντίστοιχη μελέτη για το στέλεχος Enterobacter sp. FMCC-208 όπου προσδιορίστηκε η επίδραση διαφορετικών παραγόντων της ζύμωσης στην αύξηση και την παραγωγή 2,3-βουτανοδιόλης και ακετοΐνης. Έτσι, μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας, της τιμής του pH αλλά και της αρχικής συγκέντρωσης του υποστρώματος. To στέλεχος παρουσίασε σημαντική ικανότητα παραγωγής σε ένα μεγάλο εύρος θερμοκρασιών, αν και σε τιμές μεγαλύτερες από 37 °C, η παραγωγικότητα και η τελική απόδοση μειώθηκαν σημαντικά. Επίσης, καλύτερα αποτελέσματα σημειώθηκαν σε τιμές pH 6.5-7.0, ενώ δεν παρατηρήθηκε καθόλου αύξηση στην τιμή pH=5.0. Όσον αφορά στην παρεμπόδιση εκ του υποστρώματος, αυτή παρατηρήθηκε σε αρχική συγκέντρωση σακχαρόζης μεγαλύτερη από 90 g l-1, ενώ το στέλεχος κατανάλωσε τη συνολική πηγή άνθρακα στις μικρότερες αρχικές συγκεντρώσεις. Η μελέτη του συγκεκριμένου στελέχους συνεχίστηκε όπως και για το προηγούμενο στέλεχος (K. oxytoca FMCC-197) με την καλλιέργειά του χρησιμοποιώντας διαφορετικές πηγές άνθρακα (γλυκόζη, φρουκτόζη, μαννόζη, ξυλόζη, αραβινόζη, γαλακτόζη, σακχαρόζη και μελάσα). Σε όλες τις περιπτώσεις καταναλώθηκε όλη η πηγή άνθρακα οδηγώντας στην παραγωγή ιδιαίτερα ικανοποιητικής συγκέντρωσης τελικού προϊόντος. Τέλος, αξιολογήθηκε η ικανότητα του στελέχους Enterobacter sp. FMCC-208 να αποχρωματίζει τη μελάσα σε αναερόβιες και αερόβιες συνθήκες, με το ποσοστό να ξεπερνά το 25% και στις δυο περιπτώσεις. Λαμβάνοντας υπόψιν τα αποτελέσματα των παραπάνω ζυμώσεων, πραγματοποιήθηκαν ημι-συνεχείς τροφοδοτούμενες καλλιέργειες σε βιοαντιδραστήρα κάτω από διαφορετικές συνθήκες, με στόχο τη βελτιστοποίηση της βιοδιεργασίας. Οι δύο πρώτες ημι-συνεχείς τροφοδοτούμενες καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν στους 30 °C κάτω από αναερόβιες και αερόβιες συνθήκες, χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα μίγμα μελάσας και σακχαρόζης. Η συγκέντρωση του τελικού προϊόντος ήταν σημαντικά υψηλότερη στην περίπτωση των αερόβιων συνθηκών. Πιο συγκεκριμένα, η τελική συγκέντρωση της 2,3-βουτανοδιόλης ήταν 90.3 g l-1 και της ακετοΐνης 10 g l-1. Οι τιμές αυτές μπορούν να χαρακτηριστούν ως αρκετά ικανοποιητικές σε σχέση με τη διεθνή βιβλιογραφία. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ημι-συνεχής τροφοδοτούμενη καλλιέργεια σε βιοαντιδραστήρα στους 37 °C χρησιμοποιώντας μελάσα και σακχαρόζη ως πηγή άνθρακα, έτσι ώστε τα αποτελέσματα να συγκριθούν με τα αντίστοιχα στους 30 °C. Αν και η τελική συγκέντρωση προϊόντος ήταν χαμηλότερη στους 37 °C, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στην κατ’ όγκο παραγωγικότητα του συστήματος ζύμωσης. Τέλος, πραγματοποιήθηκε ημι-συνεχής τροφοδοτούμενη καλλιέργεια σε βιοαντιδραστήρα στους 37 °C χρησιμοποιώντας τη μελάσα ως μοναδική πηγή άνθρακα. Η σημαντική μείωση της απόδοσης της ζύμωσης σχετίστηκε με την παρεμπόδιση λόγω αυξημένης παρουσίας προσμίξεων και τοξικών συστατικών οι οποίες υπάρχουν στο υπόστρωμα τύπου μελάσας. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν δυο ημι-συνεχείς ζυμώσεις σε κωνικές φιάλες, χρησιμοποιώντας στην πρώτη περίπτωση αποστειρωμένο θρεπτικό μέσο και στη δεύτερη περίπτωση μέσο που είχε υποστεί παστερίωση. Το στέλεχος Enterobacter sp. FMCC-208 παρουσίασε ικανοποιητική αύξηση και τελική παραγωγή προϊόντος ακόμα και στην περίπτωση παστεριωμένου θρεπτικού μέσου. Η παρούσα μελέτη δεικνύει ότι τα δύο άγρια στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα, ήτοι τα στελέχη Κ. oxytoca FMCC-197 και Enterobacter sp. FMCC-208, μπορούν να αξιοποιηθούν ως μικροοργανισμοί για την παραγωγή 2,3-βουτανοδιόλης και ακετοΐνης, χρησιμοποιώντας μάλιστα μεγάλη ποικιλία υποστρωμάτων χαμηλού κόστους στην προτεινόμενη βιοδιεργασία.

Aim of the study was to develop an optimized bioprocess for the efficient production of 2,3-butanediol (BDO) and acetoin (Ace). These metabolites have numerous applications and can be produced via microbial fermentations using commercial carbon sources and industrial wastes rich in carbohydrates. During the first part of this research, the potential of nine newly isolated strains, which belong to the family of Enterobacteriaceae, to produce BDO was assessed during initial batch experiments in Duran bottles using glucose and sucrose as carbon source. Although most of the strains were capable of converting both carbon sources into BDO in promising bioconversion yields and productivity rates, two of them were selected for further investigation. The implicated strains that were natural ones (viz. non-genetically modified) and food-derived, were Klebsiella oxytoca FMCC-197 and Enterobacter sp. FMCC-208. In particular, the strain Klebsiella oxytoca FMCC-197 totally consumed both carbon sources during the anaerobic batch fermentations, reaching a yield of over 0.40 g g-1 in both cases. The second strain, Enterobacter sp. FMCC-208, totally consumed both glucose and sucrose during the initial batch trials, reaching a bioconversion yield higher that 0.44 g g-1. The second part of the study focused on the investigation of different parameters (initial substrate concentration and threshold of substrate inhibition, assimilation of different carbon sources, incubation temperature, aeration) in order to optimize the process of BDO and Ace production using the strain K. oxytoca FMCC-197. Given that one of the main carbohydrates in various food wastes and residues is that of sucrose, this sugar was a principal carbon source used throughout the research. Batch cultures under anaerobic conditions and aerobic conditions were conducted using five different initial sucrose concentrations (30, 60, 90, 120 and 150 g l-1). Both in the case of anaerobic and aerobic conditions, the strain was able to totally consume the substrate when 30, 60 and 90 g l-1 were used. However, in higher initial concentrations, part of the substrate remained unconsumed, lowering the final bioconversion yield. It should also be stressed that, interestingly and in contrast to the BDO production theory, higher production values, rates and conversion yields were noted in aerobic conditions. Another set of shake flask (aerobic) experiments was performed using various carbon sources (i.e. glucose, fructose, mannose, xylose, arabinose, galactose, sucrose and molasses) in order to evaluate the ability of the strain K. oxytoca FMCC-197 to produce BDO and Ace. The final bioconversion yield was for most sugars tested higher than 0.40 g g-1. Moreover, shake flask experiments were conducted under different temperature values (25, 30, 34, 37, 40 and 42 °C), using sucrose as carbon source, in order to estimate the effect in growth, sugar consumption and BDO and Ace production. The strain was able to grow in a wide range of temperature values, however when temperature value was >37 °C, conversion yield and productivity rate were decreased. From the evaluation of the results obtained and in order to maximize BDO production, fed-batch bioreactor experiments changing different parameters were performed. Two fed-batch bioreactor experiments were conducted at 30 °C under anaerobic and aerobic conditions using molasses and sucrose as carbon sources. The final product synthesis was increased in aerobic conditions and fed-batch bioreactor experiments that followed were performed using aeration. For instance, 31 g l-1 of BDO and 7 g l-1 of Ace were produced under anaerobic conditions while 101.1 g l-1 of BDO and 14.2 g l-1 of Ace were produced under aerobic conditions. On the other hand, a fed-batch bioreactor experiment carried out at 37 °C using molasses and sucrose as carbon sources, led to a remarkably lower productivity rate. The final product synthesis was decreased as 63.0 g l-1 of BDO and 8.8 g l-1 of Ace were produced. In another fed-batch experiment, molasses were used as the sole carbon source at 30 °C, in order to investigate any substrate inhibition. Τhe final production was also reduced as 35.1 g l-1 of BDO and 8 g l-1 of Ace were produced and the productivity rate was remarkably lower. Two fed-batch experiments in shake flasks were carried out using sucrose as the sole carbon source at 30 °C. In the first case the medium had been previously sterilized while in the second one the medium had been previously pasteurized. The final yield and productivity values were lower when the medium had been previously pasteurized. On the other hand, besides BDO production, trials were carried out on molasses employed as the sole carbon source in order to observe potential color removal observed simultaneously with the production of microbial metabolites. Indeed, anaerobic and aerobic cultures performed were accompanied by a non-negligible decolorization of the medium of c. 40% and 50%, respectively. During the third part of the research, Enterobacter sp. FMCC-208 was selected in order to evaluate its ability to produce BDO and Ace, and different culture parameters were changed in order to perform optimization of the bioprocess. Preliminary tests in 1-l Duran bottles were performed using sucrose and molasses as carbon source in three different initial concentrations of total sugars (15, 30 and 60 g l-1). The strain successfully converted the whole substrate into BDO and Ace in bioconversion yields higher that 0.38 g g-1. As in the previous set of experiments with K. oxytoca, interestingly and in contrast to the theory of BDO production, the productivity rate was remarkably higher in the case of aerobic fermentations and the following batch experiments were all conducted in shake flasks. Seven different sugar substrates frequently found in food-based residues and lignocellulosic hydrolysates (i.e. glucose, fructose, mannose, xylose, arabinose, galactose, sucrose) as well as cane molasses were used from the strain Enterobacter sp. FMCC-208, that in all cases was revealed capable of producing BDO and Ace in remarkable yields (>0.36 g g-1) and productivity rates (>0.80 g l-1 h-1), with the exception of xylose employed as the sole carbon source, that was identified as a substrate that promoted lower productivity and conversion yield. From the results obtained during fermentations in different incubation temperatures (T=25, 30, 34, 37, 40 and 42 °C), the productivity rate was decreased when temperatures >37 °C were applied into the culture medium. Bacterial growth was studied using a wide range of initial sucrose concentrations in order to identify the maximum value in which no substrate inhibition was observed. In particular, 10 different initial sucrose concentrations (viz. 5, 10, 15, 20, 40, 60, 80, 110, 130 and 150 g l-1) were used in shake-flask experiments at T=37 °C. High values of specific growth rate (μmax>0.70 h-1) were obtained when the initial substrate concentration was lower than 40 g l-1. In higher initial sucrose concentrations employed, μmax values were decreased. In order to evaluate the optimum pH value for the bacterial growth and the production of BDO, four batch bioreactor experiments were carried out at constant pH values of 5.0, 6.0, 6.5 and 7.0. The strain Enterobacter sp. FMCC-208 gave better results at pH value of 6.5 and 7.0. Ιn addition, the ability of the strain to grow in shake flasks using previously pasteurized media was evaluated, using sucrose as carbon source at 37 °C. Although other bacterial species were also observed in the culture broth, the final bioconversion yield and productivity rate were satisfying, reaching a value of 0.41 g g-1 and 1.22 g l-1 h-1 respectively. From the results obtained through the previous sets of experiments using the strain Enterobacter sp. FMCC-208, different fed-batch experimental strategies were designed in order to enhance the final product synthesis. Two fed-batch bioreactor experiments were conducted at 30 °C using molasses and sucrose as carbon sources. The first one was conducted under anaerobic conditions and at the end of the fermentation 30.1 g l-1 of BDO and 5.0 g l-1 of Ace were produced reaching a yield of 0.39 g g-1. The second one was conducted under aerobic conditions. Remarkable increase was noted at the final product accumulation into the medium. Therefore, 90.3 g l-1 of BDO and 10.0 g l-1 of Ace were produced while the conversion yield of products synthesized per unit of sugar consumed was also increased (0.43 g g-1). Another fed-batch bioreactor experiment using the same combination of substrates (molasses and commercial sucrose) at 37 °C was performed and although the final production was lower, a remarkable increase in productivity rate was observed. Additionally, molasses was used as the sole carbon source in another fed-batch experiment at 37 °C in order to investigate any substrate inhibition due to the impurities of molasses. After 64 hours, 52 g l-1 of BDO and 8.7 g l-1 of Ace were produced and the bioconversion yield and the productivity were remarkably decreased. Two fed-batch experiments were also carried out in shake flasks, the one using previously sterilized medium and the other using pasteurized medium at 37 °C. Although the results were satisfying in both cases, the final yield and productivity rate were reduced in the second experiment. Finally, the decolorization of the medium was also investigated in anaerobic and aerobic cultures on molasses employed as the sole carbon source. A color removal of 25% and 35% was observed respectively. The present research, therefore, indicates that two new bacterial strains, isolated from food-stuffs, namely K. oxytoca FMCC-197 and Enterobacter sp. FMCC-208, could be regarded as possible candidates for BDO and Ace production in industrial scale, using various low-cost sugar-based substrates as microbial carbon sources.