Φαινοτυπικός και μοριακός χαρακτηρισμός μικροβιακών στελεχών Listeria monocytogenes απομονωθέντων από βιομηχανίες τροφίμων

Abstract

Ο παθογόνος μικροοργανισμός Listeria monocytogenes αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα τροφιμογενή παθογόνα σε παγκόσμια κλίμακα. Παρόλο που έχει αρκετά χαμηλή συχνότητα εμφάνισης συγκριτικά με άλλα παθογόνα των τροφίμων (π.χ. Salmonella spp), χαρακτηρίζεται από υψηλά ποσοστά θνησιμότητας (>20-30%) και νοσηλείας. Επίσης, έχει την ικανότητα να επιβιώνει σε ένα ευρύ φάσμα αντίξοων συνθηκών, γεγονός που του δίνει τη δυνατότητα να διεισδύει και να αναπτύσσεται σε διάφορα περιβάλλοντα ένα από τα οποία είναι ο ανθρώπινος γαστρεντερικός σωλήνας. Συνεπώς, ο συγκεκριμένος παθογόνος μικροοργανισμός βρίσκεται στο επίκεντρο εντατικής μελέτης από τους ερευνητές.. Ως εκ τούτου, στόχος της παρούσας μεταπτυχιακής έρευνας, αποτέλεσε η διεξοδική μελέτη των φαινοτυπικών και γονοτυπικών χαρακτηριστικών σε απομονώσεις του παθογόνου Listeria monocytogenes, με σκοπό τη βελτίωση των διαδικασιών εξυγίανσης. Οι απομονώσεις αυτές προήλθαν από προϊόντα κρέατος ελληνικών βιομηχανιών κατά την περίοδο 2014-2018. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε ο χαρακτηρισμός και η κατάταξη σε μία από τις τέσσερις κύριες οροομάδες κατά Doumith, συνολικά 273 απομονώσεων L. monocytogenes. Στη συνέχεια, επιλέχθηκαν 33 από αυτές με σκοπό τον προσδιορισμό των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών τους, όπως ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίων, όρια ανάπτυξης pH και in vitro αξιολόγηση της μολυσματικότητας. Πιο συγκεκριμένα, όσον αφορά τη μελέτη παραγωγής βιοϋμενίων η πλειονότητα των απομονώσεων χαρακτηρίστικαν ως αδύναμες, με την οροομάδα III (1/2b, 3b, 7) να έχει τη μεγαλύτερη ικανότητα παραγωγής βιοϋμενικής μάζας. Επίσης, ενδιαφέρον παρουσίασε η μεγάλη μεταβλητότητα των απομονώσεων ως προς την ικανότητά τους να διεισδύσουν στα επιθηλιακά κύτταρα. Οι απομονώσεις της οροομάδας IV (4b, 4d, 4e) χαρακτηρίστηκαν ως οι περισσότερο μολυσματικές, επαληθεύοντας το γεγονός ότι τα 4b στελέχη θεωρούνται υπεύθυνα για τα περισσότερα κρούσματα λιστερίωσης του ανθρώπου. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η ανάπτυξη των απομονώσεων σε ένα εύρος τιμών pH 4.8-8.0 όπου στη συνέχεια, με τη χρήση του μοντέλου θεμελιωδών παραμέτρων (CMP) πραγματοποιήθηκε η εκτίμηση των οριακών τιμών pΗ για κάθε απομόνωση και οροομάδα. Η οροομάδα III (1/2b, 3b, 7) είναι εκείνη που εκτιμάται ότι έχει το μεγαλύτερο εύρος ανάπτυξης (pH 4.81 – 9.80) καθιστώντας ίσως τις απομονώσεις της πιο ανεκτικές όσον αφορά την επίδραση του pH. Τέλος, μελετήθηκε η ύπαρξη πιθανών σχέσεων μεταξύ των παραπάνω φαινοτυπικών χαρακτηριστικών και των οροομάδων, που θα βοηθούσε στην εξαγωγή συμπερασμάτων και στην καλύτερη κατανόηση όσον αφορά τον επιπολασμό και την επικινδυνότητα συγκεκριμένων οροτύπων.

Listeria monocytogenes is considered as one of the major foodborne pathogens worldwide. Despite its low incidence compared to other pathogens, such as Salmonella spp, it is characterized by high hospitalization and mortality rates (>20-30%). In addition, L. monocytogenes has the remarkable ability to survive under a wide variety of stressful conditions, enabling it to invade and grow in various environments, such as human gastrointestinal tract. Consequently, this foodborne pathogen has always attracted research focus. The aim of this postgraduate study was to investigate in detail the phenotypic and genotypic characteristics of different industrial L. monocytogenes isolates in order to improve hygiene processes and reduce the risk of development of resistant strains. These isolates were derived from Greek meat industries during the period 2014-2018. Initially, 273 L. monocytogenes isolates were characterized and classified into four major serogroups in accordance to Doumith. Subsequently, 33 of these were selected to determine their phenotypic characteristics, such as the ability of biofilm formation, growth limits in pH and in vitro virulence assessment. Particularly, in the assessment of biofilm formation, the majority of isolations were characterized as “weak”, while serogroup III (1/2b, 3b, 7) had the highest ability to form biofilm. In addition, the isolates presented variability concerning their ability to invade human intestinal epithelial (Caco2 cells). Serogroup IV (4b, 4d, 4e) was characterized as the most invasive, verifying that 4b strains are considered responsible for the most human listeriosis cases. Also, the growth of the isolates was studied in a range of pH 4.8-8.0 and the pH limit values for each isolate were estimated using Cardinal Parameter Model (CPM). Serogroup III (1/2b, 3b, 7) was estimated to have the widest growth range (pH 4.81 – 9.80), making these isolates more tolerant to the effect of pH. Finally, the existence of possible correlations between the above phenotypic characteristics and serogroups were investigated in order to better understand the prevalence and risk of certain serotypes.