Μοριακός και φαινοτυπικός χαρακτηρισμός μικροβιακών στελεχών Salmonella spp. απομονωθέντων από μια Ελληνική βιομηχανία κρέατος

Abstract

Η σαλμονέλωση, μετά την καμπυλοβακτηρίωση, είναι η δεύτερη συχνότερα αναφερθείσα ζωονόσος στις Ευρωπαϊκές χώρες. Επί του παρόντος, σε παγκόσμιο επίπεδο, οι κυριότερες πηγές μόλυνσης για τον άνθρωπο περιλαμβάνουν προϊόντα κρέατος, παρά την επιτυχία των μέτρων ελέγχου κατά του βακτηρίου Salmonella spp. που εφαρμόζονται στην παραγωγή τροφίμων και ζωικών προϊόντων στις βιομηχανικές χώρες. Ο μικροοργανισμός Salmonella spp. είναι γνωστό ότι αποικίζει τη γαστρεντερική οδό των ζώων χωρίς να παρουσιάζει πάντα κλινικά συμπτώματα. Ως εκ τούτου, τα σφάγια μπορούν να μολυνθούν με Salmonella spp. κατά τη στιγμή της σφαγής και ολόκληρης της παραγωγικής διαδικασίας κρέατος. Κατά τη διάρκεια 5 χρόνων, ένα σύνολο 2.152 δειγμάτων ακατέργαστου κρέατος, τελικών προϊόντων, υποπροϊόντων του, από διάφορα ζώα παραγωγής, όπως επίσης περιβαλλοντικά και υγειονομικά δείγματα κατά τα στάδια της παραγωγής συλλέχθηκαν από μια ελληνική βιομηχανία κρέατος. Αυτά τα δείγματα αναλύθηκαν προς εύρεση της παρουσίας Salmonella spp. και προέκυψαν 142 απομονώσεις του μικροοργανισμού. Οι απομονώσεις του παθογόνου οροτυποποιήθηκαν και επιπλέον χαρακτηρίστηκαν ως προς το φαινοτυπικό τους προφίλ σύμφωνα με την απάντηση τους σε διαφορετικά περιβάλλοντα. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν: i) ο έλεγχος και ο χαρακτηρισμός της εμφάνισης και της διασποράς των ορότυπων του μικροοργανισμού στα διάφορα είδη κρέατος, και ii) η διερεύνηση της παραλλακτικότητας τους ως προς την ανάπτυξη τους σε διαφορετικά pH, της έκθεσης τους σε απολυμαντικά διαφορετικών συγκεντρώσεων για την εύρεση του MIC και ως προς την επιβίωση τους με την ικανότητα ανάπτυξης βιοϋμενίων. Για την επίτευξη των στόχων εφαρμόστηκαν τόσο μοριακές, όσο και μικροβιολογικές τεχνικές. Πράγματι, ο μικροοργανισμός έχει αναπτύξει μηχανισμούς αντιμετώπισης των δυσμενών συνθηκών ακόμα και σε επεξεργασμένα τρόφιμα και περιοχές όπου έχουν απολυμανθεί. Ο σχηματισμός βιοϋμενίων αποτελεί έναν από αυτούς και προβληματίζει τη βιομηχανία τροφίμων. Συγκεκριμένα, στην παρούσα μελέτη, τα ευρήματά μας, έδειξαν ότι η μόλυνση από το μικροοργανισμό ήταν συνήθης στα κρέατα λιανικής και ότι τα προϊόντα απομόνωσης Salmonella ήταν φαινοτυπικά ποικίλα. Όσον αφορά την ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίων, καμία απομόνωση δεν χαρακτηρίστηκε ως μη ικανή, ενώ 2 είναι ισχυρά ικανές και ανήκουν στον S. Infantis. Η ικανότητα αυτή προσδίδει σε όλα τα στελέχη μεγαλύτερη αντίσταση στην απολύμανση, ανθεκτικότητα στις ανοσολογικές αντιδράσεις καθώς και στις αντιμικροβιακές θεραπείες. Επίσης, εξετάστηκε η MIC των απομονώσεων σε δυο ευρέως χρησιμοποιούμενα στη βιομηχανία τροφίμων απολυμαντικά, το PAA και το BC, με μονάχα δύο απομονώσεις να έχουν διαφορετικό MIC από τις υπόλοιπες σε κάθε περίπτωση, και με το BC να είναι πιο αποτελεσματικό από το PAA ως προς τους μικροοργανισμούς. Στην τελευταία δοκιμή, αξιολογήθηκε η ανάπτυξη των απομονώσεων σε διαφορετικές τιμές pH που κυμαίνονταν μεταξύ 4.8-8.0 για την εκτίμηση των οριακών τιμών pΗ με τη χρήση ενός μοντέλου θεμελιωδών παραμέτρων (CMP). Ενδιαφέρον, παρουσίασε η μεγάλη μεταβλητότητα των απομονώσεων, ακόμα και σε επίπεδο ορότυπου, μέσα σε ένα μεγάλο εύρος τόσο ελάχιστων (3.2-4.7) όσο και μέγιστων (8.5-10) θεωρητικών οριακών τιμών. Τα φαινοτυπικά δεδομένα για κάθε πείραμα συσχετίστηκαν για την εύρεση πιθανής αλληλεξάρτησης αλλά και για την καλύτερη γνώση της συμπεριφοράς κάθε απομόνωσης.

After campylobacteriosis, salmonellosis is the second most commonly reported zoonosis at EU countries. Currently, at a global level, the main sources of humans’ infection include meat products, despite of the success of Salmonella spp. control measures implemented in food-animal production of industrialized countries. Salmonella spp. microorganism is known to colonize the gastrointestinal tract of animals without always producing clinical signs. Therefore, carcasses can become contaminated with Salmonella at the time of slaughter and the whole meat production procedure. During a 5-year period, a total of 2.152 of raw meat samples, final products, meat by-products, from several production animals, as well as environmental and hygienic samples were obtained from a Greek meat industry. These samples were analyzed for the detection of Salmonella spp. and 142 isolations of the microorganism were found. Pathogen isolates were serotyped and further characterized for their phenotypic profile according to their response to different environments. The purpose of the present study was to: (i) control and characterize the occurrence and spread of Salmonella serotypes in the meat and environment samples, and (ii) investigate their variability in their growth at different pH, exposure to different disinfectants’ concentrations to find MIC and their survival with the ability to grow biofilms. To achieve the goals, molecular as well as microbiological techniques were applied. Indeed, the microorganism has developed mechanisms to cope with adverse conditions even in processed foods and disinfected areas. The formation of biofilms is one of them and concerns the food industry. Specifically, in the present study, the findings showed that the microorganism contamination was common in retail meat and that Salmonella isolates were phenotypically diverse. Regarding the ability to form biofilms, none of the isolates were characterized as inadequate, whereas 2 produce strong biofilms and belong to S. Infantis. This ability gives all strains greater resistance to disinfection, to immune responses as well as antimicrobial therapies. The MIC of the isolates was also examined in two widely used food industry disinfectants, PAA and BC, with only two isolates having a different MIC from the others, in each case, and with BC being more effective than PAA against microorganisms. At the last test, the growth of the isolates at different pH values ranging from 4.8-8.0 was evaluated to estimate pH growth limit values using a Cardinal Parameter Model (CMP). The high variability of isolates was really interesting, even at the level of the serotype, within a wide range of both minimum (3.2-4.7) and maximum (8.5-10) theoretical limit values. The phenotypic data for each experiment were correlated to find possible interdependence and to better understand the behavior of each isolate.