Μελέτη διαφορετικών συνθηκών καταπόνησης στη φυσιολογία μεμονωμένων κυττάρων Listeria monocytogenes με τη χρήση φθορισμομετρικών τεχνικών και μικροσκοπίας

Abstract

Ο τροφιμογενής παθογόνος μικροοργανισμός Listeria monocytogenes συναντάται συχνά στη φύση και στο περιβάλλον επεξεργασίας τροφίμων και αποτελεί τον αιτιώδη παράγοντα της γνωστής νόσου, Λιστερίωσης, που χαρακτηρίζεται από ποσοστό θνησιμότητας 20-30%. Η έκθεση του μικροοργανισμού Listeria monocytogenes σε υποθανάτιες συνθήκες καταπόνησης ενδέχεται να επάγει την κατάσταση Ζώντα αλλά Μη Καλλιεργήσιμα (VBNC), η οποία εκφράζεται στοχαστικά σε επίπεδο ενός κυττάρου, με μεταβαλλόμενη ικανότητα επακόλουθης ανάκαμψης. Στόχος της συγκεκριμένης εργασίας είναι να διερευνήσει, σε επίπεδο πληθυσμού αλλά και ενός κυττάρου, την κινητική της κατάστασης Ζώντα αλλά Μη Καλλιεργήσιμα στον μικροοργανισμό L.monocytogenes, να περιγράψει την κατανομή των καλλιεργήσιμων, VBNC και νεκρών κυττάρων κατά την έκθεση σε συνθήκες καταπόνησης και να παρακολουθήσει σε πραγματικό χρόνο την ικανότητα ανάκαμψης με την χρήση βιντεομικροσκοπίας. Πιο συγκεκριμένα, δύο βακτηριακά στελέχη, το ScottA (ορότυπος 4b) και το EGD-e (ορότυπος 1/2a) υποβλήθηκαν σε όξινη καταπόνηση, σε καταπόνηση από το ευρέως χρησιμοποιούμενο απολυμαντικό, Peracetic Acid (PAA) και σε καταπόνηση λιμού σε συνδυασμό με προσθήκη αλατιού. Οι παράγοντες καταπόνησης διαλύθηκαν σε διάλυμα Ringer, χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα μέσης στατικής φάσης με τελικό πληθυσμό 109 CFU/ml, και οι θερμοκρασίες που μελετήθηκαν είναι 4 °C ή 20°C. Peroxy-acetic acid (PAA) (10, 20, 30 και 40 ppm στους 20oC, για 3ώρες) χρησιμοποιήθηκε για την επαγωγή της κατάστασης Ζώντα αλλά Μη Kαλλιεργήσιμα στον μικροοργανισμό L. monocytogenes, στέλεχος Scott-A. Προκειμένου να διαφοροποιηθεί ο ανθεκτικός υποπληθυσμός από τον συνολικό, θρεπτικό μέσο Tryptic Soy Agar με 0.6% Yeast Extract (TSAYE) συμπληρωμένο ή όχι με 5% w/v NaCl χρησιμοποιήθηκε συγκριτικά. Τα κύτταρα VBNC προσδιορίστηκαν συγκρίνοντας αποτελέσματα από την μέθοδο της επιφανειακής επίστρωσης και της Μικροσκοπίας Φθορισμού, χρησιμοποιώντας συνδυασμό των φθοροφόρων cFDA και Ιωδιούχο Προπίδιο. Σε κάθε χρονική στιγμή δειγματοληψίας αποτυπώθηκε και μία φωτογραφία από το Μικροσκόπιο Φθορισμού. Η ικανότητα της ανάκαμψης παρακολουθήθηκε επάνω σε TSAYE στους 37 oC. Όσον αφορά το απολυμαντικό PAA, ο μικροοργανισμός L. monocytogenes παρέμεινε καλλιεργήσιμος μετά από την έκθεση σε 20 και 30 ppm PAA για 3 ώρες. Στα 40ppm, ο συνολικός πληθυσμός έχασε την καλλιεργησιμότητά του ήδη από την πρώτη ώρα έκθεσης. Παρόλα αυτά, τα κύτταρα παρέμειναν CFDA-θετικά , εκπέμποντας πράσινο φθορισμό, υποδεικνύοντας την επαγωγή της κατάστασης VBNC. Ύστερα από έκθεση στα 40ppm δεν παρατηρήθηκε ικανότητα ανάκαμψης των κυττάρων. Υστέρα από έκθεση σε 20 και 30 ppm PAA ο χρόνος γενεάς είχε επιμηκυνθεί (150 ± 30 λεπτά) συγκριτικά με μη επεξεργασμένα κύτταρα (40 ± 15 λεπτά). Εικόνες μικροσκοπίας μετά από 18 ώρες έδειξαν διακύμανση του δυναμικού ανάκαμψης, αποτυπώνοντας μεμονωμένα κύτταρα, που δεν είχαν διαιρεθεί, ανάμεσα σε μικρο-αποικίες με μεταβλητούς αριθμούς κυττάρων. Η παρούσα μελέτη θα μπορούσε να συμβάλει στην εκτίμηση της κινητικής της κατάστασης VBNC αποκαλύπτοντας τους κινδύνους κατανάλωσης τροφής που εμπεριέχουν κύτταρα σε κατάσταση ληθάργου.

Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen often found in nature and in food processing environment and the causal agent of the well-known infection, Listeriosis, with a mortality rate of 20-30%. Exposure of Listeria monocytogenes to sub-lethal food related stresses may induce a Viable-But-Non-Culturable (VBNC) state that is stochastically expressed at single-cell level, with varying capacity in subsequent recovery. The aim of this study is to investigate, at population and single cell level, the kinetics of VBNC state to L. monocytogenes, to describe the distribution of culturable, VBNC and dead cells during exposure to stress and to monitor real-time resuscitation with direct cell imaging. More specifically, two bacterial strains, ScottA (serotype 4b) and EGD-e (serotype 1/2a) were subjected to acidity stress, to the commonly used disinfectant agent Peroxy-acetic acid (PAA) and to starvation conditions with the addition of salt in the medium. The stress agents were dissolved in Ringer’s solution and after the initial exposure of 109 CFU inoculum of bacteria in mid stationary growth phase, the cells were incubated in two temperatures, 4oC or 20OC. Peroxy-acetic acid (PAA) (10, 20, 30 and 40 ppm at 20oC for 3 h) was used to induce the VBNC state of L. monocytogenes Scott-A. To differentiate the resistant sub-population from the total, Tryptic Soy Agar with 0.6% Yeast Extract (TSAYE) supplemented or not with 5% w/v NaCl was comparatively used. VBNC cells were determined by comparing plate counts with fluorescent microscopy, using combinations of CFDA and Propidium-Iodide. Each time point corresponded to a fluorescent microscope snapshot. Resuscitation on TSAYE was monitored with time-lapse microscopy at 37oC. Regarding the disinfectant agent PAA, L. monocytogenes remained culturable after exposure to 20 and 30 ppm PAA for 3 h. At 40 ppm, the whole population became non-culturable from the first hour. However, cells appeared as CFDA-positive (emitting green fluorescence), indicating viability and thus, induction of VBNC state. No resuscitation was evident after treatment with 40 ppm. 20 and 30 ppm PAA resulted in longer individual generation times (150 ± 30 minutes) compared to untreated cells (40 ± 15 min). Microscopy images after 18 h showed variation in resuscitation potential from non-dividing single cells to micro-colonies with variable cell numbers. The present study could contribute to the assessment of VBNC kinetics shedding light into risks of consuming food with dormant cells.