Βιοτεχνολογική αξιοποίηση παράπλευρων ρευμάτων βιομηχανιών τροφίμων για την παραγωγή πολυ (3- υδροξυβουτυρικού) εστέρα μέσω βακτηριακών ζυμώσεων

Abstract

Η συσσώρευση των πλαστικών πετροχημικής προέλευσης στο περιβάλλον καθώς και η μη αποικοδόμησή τους, συνιστά ένα από τα μεγαλύτερα περιβαλλοντικά προβλήματα. Έτσι λοιπόν παρατηρείται μία έντονη τάση αντικατάστασής τους από βιογενή-βιοαποικοδομήσιμα πλαστικά με χαμηλό περιβαλλοντικό αντίκτυπο. Το πλέον μελετημένο μέλος των PHAs - το PHB – είναι γραμμικός πολυεστέρας που αποτελείται από μονομερή 3-υδροξυβουτυρικού οξέος. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η αξιοποίηση αλευρούχων αποβλήτων, συγκεκριμένα του πιτύρου σίτου, για την παραγωγή πολυ(3-υδροξυβουτυρικού) εστέρα (PHB) μέσω βακτηριακών ζυμώσεων με τη χρήση του μικροοργανισμού Burkholderia sacchari IPT 101. Για τον σκόπο αυτό πραγματοποιήθηκαν πειράματα όπου μελετήθηκαν η κινητική ανάπτυξη της βιομάζας, η κατανάλωση του υποστρώματος, η κατανάλωση αζώτου που περιέχεται στις ελεύθερες αμινομάδες πεπτιδίων και αμινοξέων, η κατανάλωση ανόργανου φωσφόρου και η παραγωγή του PHB. Αρχικά διεξήχθησαν πειράματα διαλείποντος έργου σε κωνικές φιάλες, όπου διερευνήθηκε η επίδραση της πηγής αζώτου στη μικροβιακή αύξηση. Οι καλλιέργειες αυτές διεξήχθησαν με και χωρίς την προσθήκη πηγής αζώτου στο θρεπτικό μέσο αναπτυξης. Η πηγή αζώτου που χρησιμοποιήθηκε ήταν οργανικό άζωτο από εκχύλισμα ζύμης (1 g/L) και τα αποτελέσματα των πειραμάτων αυτών έδειξαν διπλάσιες τιμές στην συγκέντρωση της ολικής ξηρής μάζας (6,05 g/L) στην περίπτωση όπου χρησιμοποιήθηκε οργανικό άζωτο στο θρεπτικό μέσο. Επίσης, στα πειράματα όπου χρησιμοποιήθηκε εκχύλισμα ζύμης στις ζυμώσεις παρατηρήθηκε παραγωγή PHB (2,42 g/L) σε αντίθεση με τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν απουσία αζώτου όπου δεν επετεύχθη παραγωγή του βιοπολυμερούς. Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκαν καλλιέργειες διαλείποντος έργου σε κωνικές φιάλες του μικροοργανισμού B.sacchari σε διαφορετικά εμπορικά σάκχαρα (γαλακτόζη, ξυλόζη, αραβινόζη, μαννόζη) με στόχο την προσομοίωση της σύστασης του υδρολύματος πιτύρου σίτου. Η μεγαλύτερη απόδοση προϊόντος (0,094 g/g) αλλά και παραγωγικότητας προϊόντος (0,048 g/(L×h)), επετεύχθησαν στην περίπτωση της γαλακτόζης. Για την γλυκόζη πραγματοποιήθηκαν πειράματα σε κωνικές φιάλες των 2 L με ενεργό όγκο 800 mL. Στην περίπτωση αυτή η συγκέντρωση βιομάζας εφτάσε στα 7,37 g/L, η απόδοση προϊόντος 0,1 g/g και η παραγωγικότητα προϊόντος 0,057g/(L×h). Ωστόσο ο αερισμός φαίνεται να επηρέαζε αρκετά τα αποτελέσματα και για αυτό ακολούθησαν καλλιέργειες διαλείποντος έργου του μικροοργανισμού, σε φιάλες των 500 mL για τη γλυκόζη, ξυλόζη και αραβινόζη. Οι τιμές της συνολικής βιομάζας, της απόδοσης και παραγωγικότητας προϊόντος ήταν ψηλότερες σε σχέση με αυτές των αρχικών πειραμάτων. Η απόδοση προϊόντος στην περίπτωση της γλυκόζης (0,13 g/g), είχε παρόμοια τιμή με αυτή της αραβινόζης (0,16 g/g). Η ενδοκυτταρική συσσώρευση επίσης ήταν ίδια (60%), ενώ η παραγωγικότητα ήταν μεγαλύτερη στην περίπτωση της γλυκόζης (0,084 g/(L×h)). Στην περίπτωση της ξυλόζης οι τιμές ήταν αρκετά χαμηλές. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκαν πειράματα σε κωνικές φιάλες, σε διαφορετικά εμπορικά σάκχαρα αλλά για διαφορετικούς αρχικούς λόγους C/FAN. vi Αυτή τη φορά μελετήθηκε η επίδραση του αρχικού λόγου C/FAN τόσο στην ανάπτυξη της βιομάζας και στον ειδικό ρυθμό ανάπτυξης του μικροοργανισμού, όσο και στην παραγωγή και συσσώρευση του PHB. Οι λόγοι που εξετάστηκαν ήταν περίπου 40, 80, και 160 g/g. Ο μεγαλύτερος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης του μικροοργανισμού σε υπόστρωμα γλυκόζης (0,51 h -1 ), ξυλόζης (0,30 h -1 ), αραβινόζης (0,21 h -1 ), γαλακτόζης (0,44 h -1 ), επετεύχθη στον μικρότερο λόγο C/FAN. Στην περίπτωση της γλυκόζης, στον λόγο C/FAN = 140 g/g το ποσοστό ενδοκυτταρικής συσσώρευσης έφτασε σε υψηλότερες τιμές (61,17%) σε σχέση με τους άλλους δύο λόγους. Στην περίπτωση της ξυλόζης οι αποδόσεις προϊόντος (0,11 g/g), βιομάζας (0,29 g/g) και παραγωγικότητας προϊόντος (0,038 g/L) είχαν υψηλότερες τιμές στον μικρότερο αρχικό λόγο (C/FAN=47 g/g) σε σχέση με τους άλλους δύο λόγους. Στην περίπτωση της γαλακτόζης, τόσο στον αρχικό λόγο C/FAN = 44 g/g όσο και στον λόγο C/FAN=100 g/g, ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης του μικροοργανισμού, η απόδοση και η παραγωγικότητα προϊόντος παρουσιάζουν παρόμοιες τιμές. Τέλος, στην περίπτωση της αραβινόζης, η μέγιστη απόδοση προϊόντος (0,16 g/g) και η μέγιστη παραγωγικότητα προϊόντος (0,051 g/(L×h), επετεύχθησαν στον λόγο C/FAN=150 g/g. Ακολούθως, έλαβαν χώρα ζυμώσεις ημισυνεχούς λειτουργίας σε βιοαντιδραστήρα, με πηγή άνθρακα διαφορετικά εμπορικά σάκχαρα (γλυκόζη, ξυλόζη) στον βέλτιστο λόγο C/FAN. Στην περίπτωση της γλυκόζης, η μέγιστη τιμή συνολικής βιομάζας (31,52 g/L) και PHB (17,56 g/L) επετεύχθησαν στις 56 h. Στην περίπτωση της ξυλόζης η μέγιστη τιμή συνολικής βιομάζας (20,76 g/L) και PHB (11,83 g/L) επετεύχθησαν στις 56 h. Ζύμωση στερεάς κατάστασης σε πίτυρο σίτου έλαβε χώρα με σκοπό κυρίως την παραγωγή γλυκοαμυλάσης με χρήση του μύκητα Aspergillus awamori. Πραγματοποιήθηκε μελέτη της παραγωγής της γλυκοαμυλάσης κατά τη διάρκεια της ζύμωσης. Η μέγιστη ενεργότητα του ενζύμου (67,5 U/g) επετεύχθη στις 71 h. Τα παραγόμενα ένζυμα χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή υδρολύματος πιτύρου σίτου. Στο εν λόγω υδρόλυμα ρυθμίστηκε ο βέλτιστος αρχικός λόγος C/FAN και ακολούθως, το υδρόλυμα χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή PHB σε βιοαντιδραστήρα μέσω ζύμωσης ημισυνεχούς τροφοδοσίας. H μέγιστη τιμή συνολικής βιομάζας (26,63 g/L) και PHB (13,05 g/L) επετεύχθησαν στις 55 h ζύμωσης με ενδοκυτταρική συσσώρευση ίση με 49%. Η απόδοση μετατροπής των σακχάρων σε PHB ήταν 0,14 g/g και η παραγωγικότητα προϊόντος 0,25 g/(L×h). Tέλος, πραγματοποιήθηκε ανάκτηση PHB από την βιομάζα που παρήχθη στον βιοαντιδραστήρα. H μέγιστη ανάκτηση PHB (86,7%) παρατηρήθηκε στην βιομάζα που προέκυψε από τη ζύμωση ημισυνεχούς τροφοδοσίας σε θρεπτικό μέσο γλυκόζης.

The accumulation of petroleum-based polymers in the environment and their degradation inability is one of the major environmental problems. Thus, there is a strong tendency to be replaced by biobased-biodegradable plastics which have a low environmental impact. The most studied member of PHAs – PHB – is a linear polyester consisting of 3-hydroxybutyric acid monomers. The purpose of the present work is the valorization of flour industry by-products, specifically of wheat bran, for poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) production via bacterial fermentations using the microorganism Burkholderia sacchari IPT 101. Experiments were carried out in order to study the microbial growth, the consumption of the substrate, the consumption of free amino nitrogen, the consumption of inorganic phosphorus and the production of PHB. Initially, shake flask experiments were carried out in order to investigate the effect of the nitrogen source on microbial growth. These cultures were carried with or without additional nitrogen source supplementation. The nitrogen source used was yeast extract (1 g/L). The results showed higher biomass concentration (TDW=6.05 g/L) when yeast extract was added in the culture medium, resulting also in a PHB concentration of 2.42 g/L. No biopolymer accumulation was observed when no yeast extract was added. Shake flasks cultures of B.sacchari were carried out on different commercial sugars (galactose, xylose, arabinose, mannose) in a similar composition to wheat bran hydrolysate. The highest product yield (0.094 g/g) and productivity 0.048 g/(L×h) were achieved in the case of galactose. In the case of glucose, batch experiments were performed in 2 L shake flasks with 800 mL working volume. In this case, biomass concentration reached 7.37 g/L, the product yield reached 0.1 g/g and the productivity reached 0.057g/(L×h). However, the aeration seemed to have a significant effect on microbial growth and product formation and for this reason batch cultures were carried out in 500 mL flasks for glucose, xylose, arabinose. Total biomass, product yield and productivity were higher than those of the initial experiments. The product yield in the case of glucose (0.13 g/g) was similar to that of arabinose (0.16 g/g). Intracellular accumulation had a similar (60%), while the productivity was higher in the case of glucose 0.084 g/(L×h). In the case of xylose the values were quite low. Shake flasks experiments were subsequently carried out on different commercial sugars, for different initial C/FAN ratios. The effect of the initial C/FAN ratio on the specific growth rate and on PHB production was evaluated. The ratios examined were 40, 80,160 g/g. The highest specific growth rate of the microorganism on glucose (0.51 h-1 ), xylems (0.30 h-1 ), arabinose (0.21 h-1 ), galactose (0.44 h-1 ), were achieved at the lowest C/FAN ratio. In the case of glucose, the intracellular PHB accumulation reached higher values (61.17%) at the ratio of C/FAN = 140 g/g. In the case of xylose, the product yield (0.11 g/g), biomass yield (0.29 g/g) and product productivity (0.038 g /L) were higher at the lowest initial ratio (C/FAN = 47 g/g). In the case of galactose, the specific growth rate, the product yield and the viii productivity had similar values at the ratios of C/FAN = 100 g/g and C/FAN = 44 g/g. Finally, in the case of arabinose, the maximum product yield (0.16 g/g) and productivity (0.051 g/ (L×h)) were achieved at the ratio of C/FAN = 150 g/g. Fed-batch fermentation was subsequently carried out in a bioreactor using as a carbon source different commercial sugars (glucose, xylose) at the optimum C/FAN ratio. In the case of glucose, the highest total biomass (31.52 g/L) and PHB (17.56 g/L) were reached after 56 h. In the case of xylose, the highest total biomass (20.76 g/L) and PHB (11.83 g/L) were reached after 56 h. Solid state fermentation on wheat bran was conducted aiming to crude enzyme production using the fungal strain Aspergillus awamori. The production of glucoamylase throughout fermentation has been evaluated. The highest glucoamylase activity (67.5 U/g) was achieved after 71 h. The produced enzymes were used for wheat bran hydrolysate production. In this hydrolysate, the optimal initial C/FAN ratio was adjusted and then, the hydrolysate was used for PHB production in a bioreactor via fed-batch fermentation. The maximum total biomass (26.63 g/L) and PHB concentration (13.05 g/L) were reached after 55 h with a 49% intracellular PHB accumulation. PHB yield reached 0.14 g/g and the productivity reached 0.25 g/(L×h). Finally, PHB was recovered from the biomass with the highest PHB recovery (86.7 %) observed in the biomass produced via fed-batch fermentation on glucose.