Ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα Tbx5 στη διαφοροποίηση των πρώιμων καρδιακών κυττάρων

Abstract

Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγίειας (ΠΟΥ) τα καρδιαγγειακά νοσήματα είναι η πρώτη παγκοσμίως αιτία θανάτου. Η κυριότερη εξ αυτών, δηλαδή το έμφραγμα του μυοκαρδίου (MI), μπορεί να οδηγήσει στην απώλεια των καρδιομυοκυττάρων (CMs), και τελικά σε καρδιακή ανεπάρκεια. Στα θηλαστικά, ένας τέτοιος τραυματισμός οδηγεί στον οριστικό θάνατο των καρδιομυοκυττάρων και σε μόνιμη ινώδη ουλή, αφού πρόκειται για κύτταρα μετα-μιτωτικά, τα οποία δεν αυτό-ανανεώνονται. Από την άλλη, τα αμφίβια και το zebrafish, έχουν την ικανότητα να αναγεννούν τους τραυματισμένους ιστούς, συμπεριλαμβανομένης και της καρδιάς. Σήμερα είναι γνωστό ότι η εμβρυϊκή καρδιά σχηματίζεται από δύο καρδιακά πεδία, από τα πρώιμα καρδιακά κύτταρα (CPCs) του πρωτογενούς καρδιακού πεδίου (FHF) που είναι μονοδύναμα και θα δώσουν τα πρώτα διαφοροποιούμενα CMs, και τα CPCs του δευτερογενούς (SHF), που είναι κύτταρα πολυδύναμα και διαφοροποιούνται σε CMs, αγγειακά λεία μυϊκά κύτταρα (vSMCS) και ενδοθηλιακά κύτταρα (ECs). Η εμφάνιση του FHF σηματοδοτείται από την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Tbx5. Ωστόσο, επειδή τα ανατπυξιακά μονοπάτια της καρδιάς δεν έχουν αποσαφηνιστεί πλήρως, πολλές μελέτες εστιάζουν το ενδιαφέρον τους στην in vitro απόκτηση και ανάλυση διαφόρων CPC πληθυσμών. Έτσι, στα πλαίσια της παρούσας διπλωματικής, έγινε in vitro διαφοροποίηση των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων ποντικού (mESCs) προς CPCs και CMs, με χρήση της κυτταρικής σειράς Tbx5creERT2/ROSA26eYFP/eYFP, για την απόκτηση του βέλτιστου πληθυσμού CPCs. Η επαγωγή και εξειδίκευση του καρδιακού μεσοδέρματος έγινε με τη χρήση των κυτταροκινών VEGF, BMP4, Activin A, bFGF και FGF10, σε καλλιέργεια μονοστιβάδας και εμβρυοειδών σωματίων. Έπειτα, από τη χορήγηση της 4-ΟΗΤ καθόλη τη διάρκεια της διαφοροποίησης, η κυτταροειδική έκφραση του Tbx5 σηματοδοτείται από την έκφραση της πρωτεΐνης eYFP. Από τη διαφοροποίηση αυτή προέκυψε ένας ετερογενής πληθυσμός CM, SMC και EC κυττάρων, ενώ η έκφραση του Tbx5 εντοπίστηκε μόνο στα CM, επιβεβαιώνοντας το μονοδύναμο χαρακτήρα των Tbx5+ κυττάρων. Η τεχνική ομοιογένεια κατά την υλοποίηση τέτοιων πρωτοκόλλων είναι αναγκαία, για την αποφυγή τεχνικών διακυμάνσεων, όπως προέκυψε από διαφορές μεταξύ των αποτελεσμάτων της ανοσοκυτταροχημικής ανάλυσης. Κατά την πρώιμη ανάπτυξης της καρδιάς, τα πολυδύναμα CPCs και των δύο καρδιακών πεδίων εκφράζουν στην επιφάνειά τους τις πρωτεΐνες Pdgfra και Gfra2. Μέσω μίας σειράς πειραμάτων με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής-φθορισμού προέκυψε ότι ο διπλά θετικός Pdgfra+/Gfra2+ εμφανίζεται σε μεγαλύτερο ποσοστό μεταξύ της 7ης και 9ης ημέρας διαφοροποίησης, και φθίνει μετά τη 10η ημέρα. Επιπλέον, ο πληθυσμός αυτός, όπως προέκυψε από τα ίδια πειράματα, κατανέμεται μεταξύ των Kdrlow και Kdr- κυττάρων. Για το διαχωρισμό του FHF και του SHF, και την απομόνωση του πρώτου για την περαιτέρω ανάλυσή του, σημαντική ένδειξη αποτελεί η έκφραση του Tbx5. Τα κύτταρα που εκφράζουν τον Tbx5 συναντώνται την 7η ημέρα στον πληθυσμό Kdrlow/Pdgfra+/Gfra2+, και φαίνεται να έχουν πολλαπλασιαστεί την 9η ημέρα, ενώ συναντώνται σε μικρότερο αριθμό στον Kdr-/Pdgfra+/Gfra2+ την 7η ημέρα, αριθμός που μειώνεται μέχρι την 9η ημέρα. Συνοψίζοντας, η απομόνωση των Kdrlow/Pdgfra+/Gfra2+/Τbx5+ CPCs την 9η ημέρα της διαφοροποίησης αποτελεί τη βέλτιστη χρονική στιγμή για την απόκτηση των CPCs του FHF. H συμβολή των CPCs του FHF στα πρώτα διαφοροποιούμενα καρδιομυοκύτταρα, έχει συσσωρεύσει το ενδιαφέρον πολλών ερευνητικών ομάδων στον μεταγραφικό παράγοντα Tbx5. Η απομόνωση και ανάλυση ενός τέτοιου πληθυσμού από το ποντίκι, κατά την εμβρυϊκή ή και κατά την ενήλικη ζωή κρίνεται αναγκαία έτσι ώστε να έρθουν στο φως νέα ευρήματα αναφορικά με τα αναπτυξιακά μονοπάτια της καρδιάς. Για το σκόπο αυτό, μέσω των διασταυρώσεων τριών γενεών F0, F1 και F2, αποκτήθηκε η F3 γενιά και το διαγονιδιακό μοντέλο Tbx5creERT2/ROSA26eYFP/eYFP. Τέλος, για την επιβεβαίωση του ρόλου του Tbx5 στην ανάπτυξη της καρδιάς, πραγματοποιήσαμε ενέσεις αντισημαινόντων ολιγονουκλεοτιδίων μορφολίνης έναντι του tbx5a σε έμβρυα του ψαριού ζέβρα (zebrafish). Αυτό οδήγησε στην εμφάνιση περικαρδιακού οιδήματος, βραδυκαρδίας, αδυναμία ολοκλήρωσης της δεξιάς στροφής του μυοκαρδίου, απώλεια του οφθαλμού του θωρακικού πτερυγίου και τελικά στο θάνατο των εμβρύων μετά τις 5-6 μετά τη γονιμοποίηση, ευρήματα που βρίσκονται σε συμφωνία με προηγούμενη βιβλιογραφία.

According to World Health Organization (WHO), cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death globally. Among the most common CVDs is myocardial infraction (MI) leading to progressive cardiomyocyte (CM) loss and eventually to fatal heart failure. In mammals, MI often results in permanent CM death followed by formation of fibrotic scar. The mammalian heart lacks the regenerative ability to replenish damaged/lost CMs. In contrast, amphibians and zebrafish maintain the capacity to regenerate injured tissues, including the heart, throughout life. The embryonic heart is formed from two sources of cardiac progenitor cells (CPCs), those that occupy the first heart field (FHF) (i.e. cardiac crescent) and those found in second heart field (SHF). Seminal studies have indicated that the earliest differentiating CMs derive from unipotent FHF CPCs, while SHF CPCs are multipotent progenitor cells, able to differentiate towards CMs, vascular smooth muscle cells (vSMCs) and endothelial cells (ECs). It is now evident that the appearance of FHF is marked by the expression of the cardinal transcription factor Tbx5, both in mammals and lower vertebrates. However, since signalling pathways of heart development are not yet fully determined, it is important to delineate how to obtain homogeneous CPC populations in vitro for cell-based therapies. In this study, we established a defined in vitro differentiation regime of mouse embryonic stem cells (mESC) cell line carrying a tamoxifen-induced bacterial artificial chromosome (BAC) Tbx5creERT2/ROSA26eYFP/eYFP transgene towards CPCs and CMs, for the acquisition of the optimal CPC populations. In this differentiation protocol we used cytokines VEGF, BMP4, Activin A, bFGF and FGF10, for the induction and specification of cardiac mesoderm, in monolayer and embryoid body (EB) cultures. Tamoxifen administration throughout mesodermal differentiation led to the identification of cell-specific expression of Tbx5 via the expression of eYFP protein. The outcome of this differentiation was an heterogenous population consisting of CM, SMC and EC cells, while the expression of Tbx5 was restricted to CMs, confirming the unipotent character of Tbx5+ CPCs. Technical uniformity was essential during the implementation of these sensitive processes in order to avoid technical fluctuations, as was suggested from differences in the results of immunocytochemical analysis. During early stages of cardiogenesis, multipotent CPCs of both heart fields express cell surface markers Pdgfra and Gfra2. Through a series of Fluorescence-activated cell sorting (FACS) experiments, we concluded that double positive population Pdgfra+/Gfra2+ reaches a peak between differentiation days 7 and 9, and begins to decrease at differentiation day 10. This population is distributed between Kdrlow and Kdr- cells. Segregation of FHF and SHF, as well as isolation and further analysis of FHF, is mostly based on the expression of Tbx5. Tbx5-expressing cells are detected on day 7 in Kdrlow/Pdgfra+/Gfra2+ population, and they seem to have expanded by day 9, while their number remained unchanged in Kdr-/Pdgfra+/Gfra2+ population between days 7 and 9. In summary, isolation of Kdrlow/Pdgfra+/Gfra2+/Τbx5+ CPCs at differentiation days 7-9 constitutes the optimal strategy for the acquisition of CPCs. Contribution of FHF CPCs in the first differentiating CMs has raised the interest of different research groups for Tbx5. Isolation and analysis of this population from a mouse model, during embryonic development or adult life is necessary to shed light on developmental pathways of cardiogenesis. For this purpose, we performed genetic crosses of 3 generations F0, F1 and F2, to acquire F3 generation and the transgenic model Tbx5creERT2/ROSA26eYFP/eYFP. Finally, in order to confirm the role of Tbx5 in heart development, we carried out morpholino injections in zebrafish embryos directed against the tbx5 translational start site (tbx5-MO). This resulted in a phenotype previously described in past litearature characterized by the appearance of pericardial edema, slower heart beat, failure to complete looping, absence of pectoral fin bud, and eventually the death of embryos at 5-6 days post-fertilization (dpf).