Μελέτη της ανάπτυξης στελεχών ζυμομυκήτων στην ακάθαρτη γλυκερόλη προς παραγωγή μεταβολικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας.

Abstract

Ο σκοπός της μελέτης ήταν η διεξαγωγή διερευνητικών πειραμάτων σχετικκά με την ικανότητα ορισμένων ζυμομυκήτων να αναπτύσσονται καταναλώνοντας ως πηγή άνθρακα την ακάθαρτη βιομηχανική γλυκερόλη και να παράγουν μεταβολίτες υψηλής προστιθέμενης αξίας. Η ακάθαρτη γλυκερόλη είναι το κύριο παραπροϊόν της διαδικασίας παραγωγής βιοντίζελ και προκύπτει από την αντίδραση μετεστεροποίησης των τριγλυκεριδίων μαζί με μια αλκοόλη, προς παραγωγή νέων εστέρων και μιας νέας αλκοόλης. Τα τελευταία χρόνια, λόγω των πολιτικών που ακολουθούνται διεθνώς αναφορικά με την αύξηση της χρήσης των βιοκαυσίμων, έχει αυξηθεί ραγδαία και η παραγωγή της γλυκερόλης. Αυτό έχει ως συνέπεια την πτώση της αξίας της ακόμα και σε αρνητικά επίπεδα λόγω της υπερεπάρκειας που έχει δημιουργηθεί. Τα στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη ανήκουν στα είδη Pichia membranifaciens, Wickerhamomyces anomalus (Pichia anomala), Kazachstania humilis και Rhodosporidium toruloides. Οι καλλιέργειες έλαβαν χώρα σε περιοριστικές σε άζωτο (Ν) συνθήκες, οι οποίες επάγουν τη σύνθεση λιπιδίων, πολυσακχαριτών και λοιπών δευτερογενών μεταβολιτών. Τα στελέχη του τελευταίου είδους (R. toruloides) καλλιεργήθηκαν ως μάρτυρες για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των υπολοίπων καθώς με βάση τα βιβλιογραφικά δεδομένα τα περισσότερα στελέχη του είδους αυτού είναι ελαιογόνα. Οι υγρές καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν σε αναδευόμενες κωνικές φιάλες Erlenmeyer των 250 mL σε υπόστρωμα ακάθαρτης γλυκερόλης αρχικής συγκέντρωσης 60 g/L. Η επώαση έγινε στις 180 στροφές ανά λεπτό, σε σταθερή θερμοκρασία 30℃ και σε ρυθμιζόμενο pH 5-6, Κατά την διάρκεια των ζυμώσεων γινόταν μέτρηση της παραγωγής βιομάζας καθώς και άλλων κινητικών, όπως της παραγωγής λίπους, της κατανάλωσης του υποστρώματος, της παραγωγής πολυολών και ενδοπολυσακχαριτών. Η μέτρηση της βιομάζας γινόταν έπειτα από φυγοκέντρηση και ξήρανση του περιεχομένου της φιάλης. Στη συνέχεια, από την ξηρή βιομάζα έγινε η εκχύλιση και ποσοτική μέτρηση του λίπους καθώς και ο προσδιορισμός των ενδοπολυσακχαριτών (IPS). Η παρακολούθηση της κατανάλωσης της γλυκερόλης και της παραγωγής πολυολών έγινε με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC). Τέλος, η ποιοτική ανάλυση των λιπιδίων έγινε αρχικά με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC) και στη συνέχεια, αφού έγινε μεθυλεστεροποίηση των λιπαρών οξέων, έγινε ανάλυση σε αέριο χρωματογράφο (GC). Από τις διαδικασίες αυτές προέκυψαν τα παρακάτω δεδομένα. Οι σημαντικότερες παραγωγές βιομάζας προήλθαν από τα εξής στελέχη: R. toruloides 48190 (17,74 g/L), P. membranifaciens N3 (14,12 g/L), W. anomalus H7A (11,36 g/L) και W. anomalus H12B (10 g/L). Την μεγαλύτερη παραγωγή μικροβιακού λίπους σημείωσαν τα: R. toruloides 48190 (5,22 g/L) και P. membranifaciens N3 (2,31 g/L). Σημαντική παραγωγή πολυολών (αραβιτόλης) σημείωσαν μόνο τα στελέχη του W. anomalus και συγκεκριμένα το Η7Α (12,47 g/L), το H12B (11,45 g/L) και το Η3Α (9,03 g/L). Το μεγαλύτερο ποσοστό ενδοπολυσακχαριτών (IPS) επί της ξηρής βιομάζας βρέθηκε στα R. toruloides 17902 (14,8%) και R. toruloides 48190 (13,2%). Αν και η παραγωγή λίπους δεν ήταν μεγάλη σχεδόν σε καμία ζύμωση, η ανάλυση των μικροβιακών λιπιδίων έδωσε ενδιαφέροντα αποτελέσματα καθώς διαπιστώθηκε από την TLC πως τα κύρια συστατικά των μικροβιακών ελαίων είναι τα τριγλυκερίδια (TAGs). Τα λιπίδια των ζυμών αναλύθηκαν και ως προς τη σύστασή τους σε λιπαρά οξέα και παρατηρήθηκε ότι σε πολλές περιπτώσεις τα λιπίδια αυτά αποτελούνταν από C16 και C18 λιπαρά οξέα (κυρίως ελαϊκό και παλμιτικό οξύ). Με ενδιαφέρον εδείχθη ότι το λίπος ορισμένων στελεχών φαίνεται να αποτελείται σε μεγάλο ποσοστό από λιπαρά οξέα με αριθμό ανθράκων >18, και κυρίως από αραχιδικό οξύ (C20:0).

The purpose of this study was to conduct a series of screening experiments regarding the ability of some yeast species to consume raw glycerol, as the carbon source, in order to produce added value metabolites. Raw glycerol is the main by-product of the biodiesel production industry and it derives from the transesterification reaction of triglycerides (TAGs) with an alcohol in order to produce another ester and another alcohol. Due to the policies of recent years, regarding biofuel use, the production of glycerol has increased tremendously. This has led to a drop in its value even to negative levels as a result of its abundance. The strains used in this study belong to the species Pichia membranifaciens, Wickerhamomyces anomalus (Pichia anomala), Kazachstania hulilis and Rhodosporidium toruloides. The experiments took place in nitrogen (N) limited conditions which stimulate the biosynthesis of lipids, polysaccharides and other secondary metabolites. The strains of the later (R. toruloides) were cultivated as a control for evaluating the others as most strains of this species, according to the literature, are oleaginous. The experiments were conducted in Erlenmeyer shake flasks of 250 mL capacity and 60 g/L initial glycerol concentration, at 180 rpm and at a constant temperature of 30℃. The pH was maintained around 5-6 throughout the cultivation. During the experiments the production of biomass was measured along with the glycerol consumption and the production of single cell oils, polyols and intracellular polysaccharides (IPS). The dry biomass was measured after centrifuging and drying the content of the flasks. After that, the lipids were extracted and measured from the dry biomass as well as the IPS. Those were measured using DNS. The glycerol consumption and the polyol production were monitored using High Performance Liquid Chromatography (HPLC). The lipid analysis was done at first using Thin Layer Chromatography (TLC) and second, with Gas Chromatography (GC) after the methyl esterification of the fatty acids. From all these methods the following data were extracted. The highest dry biomass values were achieved by the strains: R. toruloides 48190 (17.74 g/L), P. membranifaciens N3 (14.12 g/L), W. anomalus H7A (11.36 g/L) and W. anomalus H12B (10 g/L). The most notable lipid production was achieved by R. toruloides 48190 (5.22 g/L) and P. membranifaciens N3 (2.31 g/L). The polyol (arabitol) production was not particularly big but not negligible and was done by the W. anomalus strains and Η7Α (12.47 g/L), H12B (11.45 g/L) and Η3Α (9.03 g/L) in particular. The highest percentage of IPS in the dry biomass was found in R. toruloides 17902 (14.8%) and R. toruloides 48190 (13.2%). Even though the single cell oil values were not great in almost none of the experiments conducted, its analysis with TLC gave interesting results, as it revealed that it consists mainly by TAGs. The microbial lipids when analyzed in a GC revealed that in many cases, they consist of C16 and C18 fatty acids (mainly oleic and palmitic acids). It is also interesting that the lipids of some strains consist in large part of big chain fatty acids (C>18) and mainly of arachidic acid.