Μελέτη της χρόνιας νόσου των νεφρών μέσω πρωτεομικής τοπολογικής και single-cell ανάλυσης ιστολογικών δειγμάτων

Abstract

Η χρόνια νόσος των νεφρών αποτελεί μία πολυπαραγοντική συστημική ασθένεια που περιλαμβάνει ένα εύρος παθολογικών καταστάσεων των νεφρών, με πολλαπλές αρχικές αιτιολογίες και υποκείμενους μηχανισμούς. Η έγκαιρη διάγνωσή της, απαιτεί ακριβείς προγνωστικούς και διαγνωστικούς δείκτες, γι αυτό η έρευνα στρέφεται πλέον σε συστημικές προσεγγίσεις και τη διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών της ασθένειας. Στην παρούσα εργασία, βελτιστοποιήθηκε και εφαρμόστηκε το πρωτόκολλο πολυπλεκτικού ανοσοφθορισμού Μultiple Iterative Labeling by Antibody Neodeposition (MILAN) σε τομές ιστών νεφρών μονιμοποιημένες σε φορμαλίνη και παραφίνη, από υγιή άτομα και ασθενείς των σταδίων 2 και 3 της νόσου. Έπειτα, αναπτύχθηκε μια σειρά βημάτων επεξεργασίας των εικόνων με χρήση προγραμμάτων ελεύθερου λογισμικού, η οποία ανέδειξε πληροφορίες ως προς την έκφραση και τη χωρική τους κατανομή σε διαφορετικές νεφρικές περιοχές. Συνολικά, ελέγχθηκε η ταυτόχρονη έκφραση και τοπολογική κατανομή 20 πρωτεϊνών που σχετίζονται με την ασθένεια. Σε 15 από αυτές βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορετική έκφραση μεταξύ των δειγμάτων από υγιείς και ασθενείς επιβεβαιώνοντας προηγούμενα σχετικά βιβλιογραφικά δεδομένα. Ορισμένες πρωτεΐνες, εμφάνισαν μειωμένη έκφραση στο στάδιο 2 και αυξημένη έκφραση στο στάδιο 3 της ασθένειας κυρίως στα σπειράματα. Οι πρωτεΐνες αυτές έχουν συσχετιστεί με κυτταρικές διαδικασίες όπως συμμετοχή στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, τη ρύθμιση της φλεγμονώδους αντίδρασης του ιστού, τη σπειραματική διήθηση και τη νεφρική ίνωση. Επίσης, επιβεβαιώθηκε η σημαντικότητα των σηματοδοτικών μονοπατιών AGE-RAGE και TGFβ, τα οποία έχουν σχετιστεί με την ασθένεια και σε προηγούμενες μελέτες. Η παρούσα εργασία εισήγαγε μια καινοτόμα ερευνητική προσέγγιση με υψηλές δυνατότητες εξέλιξης στην έρευνα για τη χρόνια νόσο των νεφρών. Ωστόσο, απαιτείται μελλοντικά περαιτέρω μελέτη για την πληρέστερη διερεύνηση των υποκείμενων μηχανισμών της χρόνιας νεφρικής νόσου.

Chronic kidney disease (CKD) constitutes a multifactorial systemic disease that covers a wide range of renal pathological conditions, with multiple initial causes and subsequent mechanisms. Since CKD diagnostics lack accurate prognostic and diagnostic markers, the CKD research should focus on system-wide approaches and the investigation of its underlying molecular paths. In the current research, the Multiple Iterative Labeling by Antibody Neodeposition (MILAN) protocol was optimized and applied in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) kidney tissue samples. In addition, a set of 20 CKD-related proteins was tested in samples from healthy and CKD renal tissue including G2 and G3 CKD stages. Furthermore, a new method of image processing was employed, using open-source software that permitted the investigation of the proteins’ spatial distribution in different renal compartments. The changes in the relative expression of 15 proteins between the healthy and CKD condition was evaluated as statistically significant and was following previous findings. Some of them were decreased in the initial CKD stage G2 and increased in the advanced CKD Stage G3. The expression of other proteins was more rapidly reversed in the glomeruli than the renal tubules between the two CKD stages. The results verified the involvement of several proteins in the regulation of cell proliferation, tissue inflammation, glomerular filtration, and fibrosis. The molecular pathways that were generally represented from this set of proteins are the AGE-RAGE and the TGFβ signalling pathways, which have already been connected to the CKD progression. In conclusion, this research inserted a novel method in CKD research with a great perspective for the future. Nevertheless, further research is required for the detailed investigation of the underlying mechanisms of CKD.