Μελέτη της επιλογής νέων στελεχών ζυμών προς παραγωγή μεταβολικών προϊόντων προστιθέμενης αξίας χρησιμοποιώντας την ακάθαρτη γλυκερόλη ως υλικό εκκινήσεως

Abstract

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση της ικανότητας δέκα διαφορετικών ζυμών, οι οποίες δεν έχουν χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν, να αναπτύσσονται σε υδρόφιλο υπόστρωμα χαμηλού κόστους και συγκεκριμένα σε ακάθαρτη γλυκερόλη, η οποία είναι παραπροϊόν της βιομηχανικής παραγωγής βιοκαυσίμου (biodiesel). Πιο συγκεκριμένα, η ικανότητα των ζυμών να μεταβολίζουν την γλυκερόλη προς παραγωγή βιομάζας και δευτερογενών μεταβολιτών, όπως μικροβιακό λίπος και ενδοπολυσακχαρίτες κατάλληλα για χρήση στην φαρμακοβιομηχανία όσο και στην βιομηχανία τροφίμων, καθώς επίσης και πολυόλες όπως αραβιτόλη, ερυθριτόλη, μαννιτόλη. Στην πειραματική διαδικασία χρησιμοποιήθηκαν τα στελέχη Candida zeylanoides 5266, Pichia fermentans 5265 και 5257, Candida tartarivorans 5224 και 5222, Candida incospicua και 5293 και 5292, Geotrichum candidum 5274, Rhodosporidium toruloides Y-6985 και Y-1588. Με εξαίρεση τα στελέχη Rh. Toruloides Y-6985 και Y-1588 τα οποία προέρχονται από τη συλλογή στελεχών NRRL (Peoria, USA), και τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες για την παραγωγή ενδοκυτταρικών λιπιδιακών αποθεμάτων, τα άλλα στελέχη είναι προερχόμενα από Ελληνικές πρώτες ύλες και δεν έχουν μελετηθεί ως προς την παραγωγή μεταβολιτών. Έγιναν υγρές καλλιέργειες ασυνεχούς τύπου σε αναδευόμενες φιάλες Erlenmeyer των 250 mL, χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα γλυκερόλη (καθαρότητας 85% κατά βάρος) στην ίδια συγκέντρωση (60 g/L) με περιοριστικό παράγοντα αύξησης το άζωτο σε ίδιες συνθήκες καλλιέργειας (30o C και pH 6). Έγινε προσδιορισμός του ξηρού βάρους βιομάζας με το στέλεχος Rh. toruloides Y-6985 να εμφανίζει τη μέγιστη ποσότητα η οποία ανήλθε στα 12,2g/L. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε εκχύλιση των λιπιδίων για ποσοτικό προσδιορισμό με τα στελέχη Rh. toruloides Y-6985 και P. fermentans 5257 να σημειώνουν τις μέγιστες συγκεντρώσεις (3,3-2,2g/L). Στο ενδοκυτταρικό λίπος των στελεχών με την μεγαλύτερη δυνατότητα λιποσσυσώρευσης πραγματοποιήθηκαν περαιτέρω αναλύσεις. Το ενδοκυτταρικό λίπος αναλύθηκε με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC) για την γενική κατανομή και ποιοτικό προσδιορισμό του ουδέτερου λίπους. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ανάλυση με αέρια χρωματογραφία (GC) για τον προσδιορισμό της σύστασης των λιπαρών οξέων, έπειτα από την μετατροπή τους στους αντίστοιχους πτητικούς μεθυλικούς εστέρες (FAMES). Εξετάστηκε επίσης η παραγωγή ενδοπολυσακχαριτών, ο προσδιορισμός των οποίων έγινε με το αντιδραστήριο DNS και ο ποσοτικός προσδιορισμός τους με φωτόμετρο και χρήση της καμπύλης απορρόφησης. H μέγιστη παραγωγή παρουσιάστηκε από το στέλεχος G. candidum 5274 και κυμάνθηκε στα 0,30 g/L. Η παραγωγή πολυολών (μαννιτόλης, ερυθριτόλης, αραβιτόλης) καθώς και η κατανάλωση σακχάρων προσδιορίστηκε ποιοτικά αλλά και ποσοτικά μέσω υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC). Παρατηρήθηκαν αξιοσημείωτες ποσότητες παραγωγής μαννιτόλης 3,41 g/L από το στέλεχος P. fermentans 5257, αραβιτόλης 6,22 g/L και ερυθριτόλης 8,12 g/L από το στέλεχος G. candidum 5274. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι δεν προσαρμόστηκαν όλα τα στελέχη στο θρεπτικό μέσο με την ίδια απόδοση. Παρατηρήθηκε διαφοροποίηση στον ρυθμό κατανάλωσης της γλυκερόλης άρα και στην παραγωγή βιομάζας, ενδοκυτταρικού λίπους, ενδοπολυσακχαριτών και τέλος των δευτερογενών μεταβολιτών.

The purpose of this study is to investigate the ability of ten different yeasts, which have not been used in the past, to grow on a low-cost hydrophilic substrate, namely on crude glycerol, which is a by-product of industrial biodiesel production. More specifically, the ability of yeasts to metabolize glycerol to produce biomass and secondary metabolites, such as microbial fat and endopolysaccharides suitable for use in the pharmaceutical and food industries, as well as polyols such as arabitol, erythritol, mannitol. The strains Candida zeylanoides 5266, Pichia fermentans 5265 and 5257, Candida tartarivorans 5224 and 5222, Candida incospicua and 5293 and 5292, Geotrichum candidum 5274, Rhodosporidium toruloides Y-6985 and Y-1588 were used in the experimental procedure. With the exception of Rh. toruloides strains Y-6985 and Y-1588 which come from the NRRL strain collection (Peoria, USA), and which were used as controls for the production of intracellular lipid stocks, the other strains are derived from Greek raw materials. and have not been studied in terms of metabolite production. Discontinuous liquid cultures were performed in 250 mL Erlenmeyer agitated flasks using as a carbon source glycerol (purity 85% by weight) at the same concentration (60 g / L) with growth limiting nitrogen under the same culture conditions (30 ° C and pH 6). ). The dry weight of biomass was determined with the strain R. toruloides Y-6985 showing the maximum amount which amounted to 12,2 g / L. The lipids were then extracted for quantification with strains Rh. toruloides Y-6985 and P. fermentans 5257 reaching maximum concentrations (3,3-2,2 g / L). Further analyzes were performed on the intracellular fat of the strains with the highest potential for fat accumulation. Intracellular fat was analyzed by thin layer chromatography (TLC) for the general distribution and qualitative determination of neutral fat. Gas chromatography (GC) analysis was then performed to determine the composition of the fatty acids, after conversion to the corresponding volatile methyl esters (FAMES). The production of endopolysaccharides, which were determined with the DNS reagent and quantified by photometer and using the absorption curve, was also examined. The maximum production was presented by strain G. candidum 5274 and ranged at 0,30 g / L. The production of polyols (mannitol, erythritol, arabitol) as well as the consumption of sugars were determined qualitatively and quantitatively by high performance liquid chromatography (HPLC). Significant amounts of 3,41 g / L mannitol were observed from P. fermentans strain 5257, arabitol 6,22 g / L and erythritol 8,12 g / L from G. candidum strain 5274. The results showed that not all strains adapted to the nutrient medium with the same yield. There was a difference in the rate of glycerol consumption and therefore in the production of biomass, intracellular fat, endopolysaccharides and finally the secondary metabolites.