Παραγωγή μικροβιακών ελαίων κατά την καλλιέργεια στελεχών του μικροοργανισμού Cryptococcus curvatus και Rhodosporidium toruloides σε υποστρώματα με βάση την ακάθαρτη γλυκερόλη

Abstract

Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της ικανότητας της ελαιογόνου ζύμης Cryptococcus curvatus να μεταβολίζει την ακάθαρτη βιομηχανική γλυκερόλη ως πηγή άνθρακα, η οποία αποτελεί παραπροϊόν της βιομηχανίας παραγωγής βιοκαυσίμου (biodiesel). Ειδικότερα, μελετήθηκε ο μεταβολισμός της ακάθαρτης γλυκερόλης προς παραγωγή βιομάζας και δευτερογενών μεταβολιτών (μικροβιακού λίπους και ενδοπολυσακχαριτών) για διαφορετικές πηγές αζώτου στο υπόστρωμα ανάπτυξής της. Τα στελέχη της ζύμης Cryptococcus curvatus που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα ATCC 20509 και NRRL Y-1511 ενώ ως πηγές αζώτου ήταν το εκχύλισμα ζύμης (yeast extract) σε όλες τις ζυμώσεις σε ποσότητα 1g/L και σαν επιπλέον η πεπτόνη, η ουρία, το νιτρικό κάλιο, το θειικό αμμώνιο, το εκχύλισμα ζύμης και μια ζύμωση χωρίς επιπλέον πηγή αζώτου. Όλες οι ζυμώσεις έγιναν υπό περιοριστικές σε άζωτο συνθήκες, και ο λόγος άνθρακα προς άζωτο (C/N) ήταν σταθερός και ίσος με 70. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν οι δύο ζυμώσεις που έδωσαν την μεγαλύτερη τιμή βιομάζας και ενδοκυτταρικού λίπους (2 g/L πεπτόνη και 2,038 g/L νιτρικό κάλιο αντίστοιχα) με το στέλεχος Rhodosporidium toruloides NRRL Y-6984 προκειμένου να διαπιστωθεί αν θα είχε την ίδια επίπτωση στον μεταβολισμό της ζύμης. Για το στέλεχος NRRL Y-1511 πραγματοποιήθηκαν μόνο οι ζυμώσεις με πεπτόνη και χωρίς κάποια επιπλέον πηγή αζώτου, καθώς τα δευτερογενή μεταβολικά προϊόντα που παρήγαγε ήταν σε πολύ μικρό ποσοστό σε σχέση με την ξηρή βιομάζα, όποτε δεν έχρηζε περαιτέρω ανάλυσης. Σαν δεύτερο ερευνητικό αντικείμενο της παρούσας μελέτης ήταν η πραγματοποίηση δυο επιπλέον ζυμώσεων με σκοπό τον προσδιορισμό της βέλτιστης διαδικασίας για την εκχύλιση του ενδοκυτταρικού μικροβιακού λίπους. Οι εκχυλίσεις έγιναν με τοποθέτηση της βιομάζας στο αντιδραστήριο «Folch» (χλωροφόρμιο / μεθανόλη 2/1) για πέντε ημέρες, με πέψη με HCl και κατόπιν εκχύλιση με «Folch» και με βρασμό της βιομάζας εντός του αντιδραστηρίου «Folch» σε σύστημα μανδύα βρασμού – συμπυκνωτή. Οι ζυμώσεις έλαβαν χώρα σε κωνικές φιάλες των 250 mL και με αρχική συγκέντρωση της ακάθαρτης γλυκερόλης 50 g/L. Οι συνθήκες των ζυμώσεων ήταν ίδιες, με τιμή pH = 6,0±0,2, ανάδευση 180±5 rpm και θερμοκρασία Τ = 28±1 °C. Κατά το πέρας των ζυμώσεων πραγματοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισμός της ξηρής βιομάζας, του ενδοκυτταρικού λίπους και των ενδοπολυσακχαριτών. Για το παραγόμενο λίπος έγινε και ποιοτικός προσδιορισμός έπειτα από μεθυλεστεροποίηση και ανάλυση σε αέριο χρωματογράφο. Πιο συγκεκριμένα, για το στέλεχος ATCC 20509 η μεγαλύτερη παραγωγή βιομάζας παρατηρήθηκε στην ζύμωση με πηγή αζώτου την πεπτόνη, η οποία ανήλθε στα 23,68 g/L, ενώ το μεγαλύτερο ποσοστό ενδοπολυσακχαριτών είχε τιμή 0,44 g/g και παρατηρήθηκε στη ζύμωση με 0,605 g/L ουρία. Η μεγαλύτερη παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους ήταν στη ζύμωση με πηγή αζώτου το νιτρικό κάλιο, η οποία έφτασε τα 4,52 g/L. Για το στέλεχος NRRL Y-1511 η μεγαλύτερη παραγωγή βιομάζας παρατηρήθηκε στη ζύμωση με πεπτόνη ως πρόσθετη πηγή αζώτου, η οποία ανήλθε στα 16,58 g/L ενώ στην ζύμωση χωρίς πρόσθετη πηγή αζώτου παρατηρήθηκε η μέγιστη παραγωγή λίπους με τιμή 0,74 g/L και ενδοπολυσακχαριτών με τιμή 0,16 g/g. Τέλος, για το στέλεχος Rhodosporidium toruloides NRRL Y-6984, όπως και στην περίπτωση του στελέχους ATCC 20509, η μεγαλύτερη παραγωγή βιομάζας παρατηρήθηκε στην ζύμωση με πηγή αζώτου την πεπτόνη, η οποία έφτασε στα 16,4 g/L, η μεγαλύτερη παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους ήταν στην ζύμωση με πηγή αζώτου το νιτρικό κάλιο, η οποία έφτασε στα 3,32 g/L, ενώ και στις δύο ζυμώσεις το μεγαλύτερο ποσοστό ενδοπολυσακχαριτών είχε την τιμή 0,31 g/g. Τα λιπαρά οξέα τα οποία παρήγαγαν τα στελέχη και προσδιορίστηκαν με την χρήση της αέριας χρωματογραφίας ήταν τα εξής: παλμιτικό οξύ (C16:0), παλμιτελαϊκό οξύ (Δ9C16:1), στεατικό οξύ (C18:0), ελαϊκό οξύ (Δ9C18:1) , λινελαϊκό οξύ (Δ9,12C18:2) και α-λινολενικό οξύ (Δ9,12,15C18:3). Στις ζυμώσεις που πραγματοποιήθηκαν για την βέλτιστη μέθοδο εκχύλισης λίπους, η μέθοδος με «Folch» και βρασμό και η μέθοδος μόνο με τοποθέτηση της ξηράς βιομάζας εντός πενθημέρου στους διαλύτες «Folch» είχαν τα καλύτερα αποτελέσματα, όμως επιλέχθηκε η απλή μέθοδος χωρίς βρασμό για την εκχύλιση του λίπους στα πειράματα, διότι ήταν πιο σταθερή στα αποτελέσματά της.

The aim of this research was to investigate the ability of Cryptococcus curvatus and Rhodosporidium toruloides to metabolize crude glycerol as a carbon source, which is the main byproduct of biodiesel industry. In particular, the metabolism of crude glycerol upon the production of total biomass and secondary metabolites (microbial lipid and endopolysaccharides) was assessed for different sources of nitrogen employed into the growth substrate. The strains of Cryptococcus curvatus used were the ATCC 20509 and NRRL Y-1511. In all trials, yeast extract at an initial concentration adjusted to 1.0 g/L was used. Addition nitrogen source at equal nitrogen concentrations, were used the following nitrogenous compounds: peptone, urea, potassium nitrate and ammonium sulfate. In one of the trials performed, yeast extract (at 1.0 g/L) alone (without additional source of nitrogen) was used. All fermentations were performed under nitrogen-limited conditions and the carbon to nitrogen ratio (C/N) was constant and equal to 70. Finally, the two fermentations that gave the highest value of biomass and intracellular lipid (2 g/L peptone and 2,038 g/L potassium nitrate respectively) were performed with the strain Rhodosporidium toruloides NRRL Y-6984 to determine if it would have the same effect on the yeast physiological behavior. For the NRRL Y-1511 strain only the fermentations with peptone and without any additional nitrogen source were performed, as this strain did not produce noticeable quantities of total biomass and storage lipids. The second research object of the present study was to perform two additional fermentations in order to determine the optimal process for the extraction of intra-cellular microbial oil. The extractions were performed with “Folch” solvent blend (chloroform / methanol 2/1), with implication of HCl and digestion of the dry cell biomass followed by “Folch” extraction, and finally by adding “Folch” solvent blend into the dry biomass followed by boiling the mixture of solvents into a boiling-condenser system. The fermentations took place in 250 mL conical flasks with an initial concentration of crude glycerol of 50 g/L. The fermentation conditions were the same, with pH = 6 ± 2, agitation 180 ± 5 rpm and temperature T = 28±1 °C. Buring the trials, dry biomass, intracellular oil and endopolysaccharides were quantified. For the produced oil, a total fatty acid composition analysis was made after methyl esterification and analysis on a gas chromatograph. For the ATCC 20509 strain the highest biomass production was observed in the fermentation with nitrogen source peptone, which amounted to 23.68 g/L, while the highest percentage of endopolysaccharides was 0.44 g/g and was observed in the fermentation with 0.605 g/L urea. The highest production of intracellular lipid was in the fermentation with nitrogen source potassium nitrate, which reached 4.52 g/L. For the strain NRRL Y-1511 the highest biomass production was observed in the fermentation with peptone as additional nitrogen source, which amounted to 16.58 g/L while in the fermentation without additional nitrogen source the maximum lipid production was observed at 0.74 g/L and endopolysaccharides at a value of 0.16 g/g. Finally, for the strain Rhodosporidium toruloides NRRL Y-6984, as in the case of strain ATCC 20509, the highest biomass production was observed in the fermentation with nitrogen source peptone, which reached 16.4 g/L, the highest production of single cell oil was in the fermentation with nitrogen source potassium nitrate, which reached 3.32 g/L, while in both fermentations the highest percentage of endopolysaccharides was 0.31 g/g. The fatty acids produced by the strains and determined using gas chromatography were: palmitic acid (C16:0), palmitoleic acid (Δ9C16:1), stearic acid (C18:0), oleic acid (Δ9C18:1), linoleic acid (Δ9,12C18:2) and α-linolenic acid (Δ9,12,15C18:3). Single cell oil was mostly composed of the fatty acids oleic and palmitic. Due to this fatty acid composition, storage lipid of all yeasts tested seems to be quite suitable for the synthesis of “2nd generation” biodiesel. In the fermentations performed for the optimal method of intra-cellular oil extraction, the method with “Folch” and boiling and the method with simple “Folch” extraction seemed to present the best results.