Μελέτη της προσκόλλησης και του σχηματισμού βιοϋμενίου από τη ζύμη αλλοίωσης του οίνου, Brettanomyces bruxellensis

Abstract

Οι μικροοργανισμοί συναντώνται σε βιοϋμένια τα οποία αποτελούν δομημένα πολυμικροβιακά συσσωματώματα που συνδέονται σε βιοτικές και αβιοτικές επιφάνειες σχηματίζοντας ολοκληρωμένες κοινότητες. Η δημιουργία βιοϋμενίων από αλλοιογόνους μικροοργανισμούς μπορεί να έχει σημαντικές οικονομικές συνέπειες στην βιομηχανία τροφίμων και ποτών. Συχνά οι αντιμικροβιακοί παράγοντες που χρησιμοποιούνται δεν είναι σε θέση να καταστρέψουν όλα τα βιώσιμα κύτταρα του βιοϋμενίου συνεπώς η βαθύτερη κατανόηση του μηχανισμού και των παραγόντων που επηρεάζουν το σχηματισμό των βιοϋμενίων με στόχο την εύρεση νέων τρόπων αντιμετώπισης είναι αναγκαία. Αντικείμενο της παρούσας μελέτης ήταν αρχικά να αξιολογηθεί η ικανότητα προσκόλλησης και δημιουργίας βιοϋμενίων της ζύμης αλλοίωσης του οίνου, Brettanomyces bruxellensis. Αρχικά μελετήθηκε η ικανότητα προσκόλλησης έντεκα στελεχών του είδους και παράλληλα πραγματοποιήθηκε σύγκριση του δακτυλικού αποτυπώματος των πλαγκτονικών έναντι των προσκολλημένων κυττάρων με χρήση FTIR. Στη συνέχεια επιλέχθηκε ένα στέλεχος με υψηλό δυναμικό αλλοίωσης για τη βαθύτερη μελέτη του σχηματισμού του βιοϋμενίου. Συγκεκριμένα εξετάστηκαν οι παράγοντες που επηρεάζουν την προσκόλληση, η κινητική του σχηματισμού του βιοϋμενίου και η πιθανή αλλοίωση του οίνου από τα προσκολλημένα κύτταρα. Ως παράγοντες που επηρεάζουν την προσκόλληση αξιολογήθηκαν διαφορετικές συνθήκες (χαμηλό pH, αιθανόλη, διοξείδιο του θείου, κρασί, μούστος) και υλικά (ανοξείδωτο ατσάλι, γυαλί) που συναντώνται στην οινοποίηση. Για την ανάπτυξη του βιοϋμενίου με το πέρασμα του χρόνου χρησιμοποιήθηκαν κουπόνια από ανοξείδωτο ατσάλι και οι δειγματοληψίες έλαβαν χώρα στις 0, 24, 48, 72 και 144 ώρες, ενώ για το δυναμικό αλλοίωσης το «επιμολυσμένο» κόκκινο κρασί επωάστηκε στους 25oC για διάστημα δύο μηνών. Τέλος εφαρμόστηκαν νέες τεχνικές αντιμετώπισης της προσκόλλησης του στελέχους B. bruxellensis (33.1) σε κουπόνια από ανοξείδωτο ατσάλι, όπως η προσθήκη διαφορετικών συγκεντρώσεων χιτοζάνης και η παρουσία δύο διαφορε Από τα αποτελέσματα φάνηκε ότι τα στελέχη του μικροοργανισμού B. bruxellensis που εξετάστηκαν, δεν έχουν όλα την ίδια ικανότητα προσκόλλησης. Με την ανάλυση FTIR διαχωρίστηκε επιτυχώς το μεταβολικό αποτύπωμα των προσκολλημένων έναντι των πλαγκτονικών κυττάρων των έντεκα στελεχών ενώ όλα τα προσκολλημένα κύτταρα εμφάνισαν το ίδιο μεταβολικό αποτύπωμα προτείνοντας ένα πιθανό κοινό μηχανισμό προσκόλλησης για το συγκεκριμένο είδος. Όσον αφορά το στέλεχος B. bruxellensis (33.1), παρατηρήθηκε ότι οι στρεσογόνες συνθήκες του οίνου επηρεάζουν την προσκόλληση του ενώ ο πληθυσμός των προσκολλημένων κυττάρων παραμένει σταθερός τις πρώτες πέντε μέρες σχηματισμού του βιοϋμενίου. Τα προσκολλημένα κύτταρα παρουσιάζουν δυναμικό αλλοίωσης, δεδομένου ότι μετά από 2 μήνες σε επαφή με φρέσκο οίνο προκάλεσαν αλλαγές στο οργανοληπτικό προφίλ του προϊόντος. Τέλος, η χιτοζάνη και οι καλλιέργειες του O. oeni μπορούν να μειώσουν τα προσκολλημένα κύτταρα και για αυτό θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως νέοι τρόπoι αντιμετώπισης του σχηματισμού βιουμενίων. Συμπερασματικά, η Φασματοσκοπία Υπερύθρου (FTIR) μπορεί να εφαρμοστεί σαν μέθοδος ανάλυσης του βιουμενίου παρόλη την πιθανή παραλλακτικότητα που μπορεί να παρουσιάζουν τα στελέχη του είδους B. bruxellensis ως προς την ικανότητα προσκόλλησης ενώ νέοι τρόποι αντιμετώπισης είναι πιθανόν να εφαρμοστούν επιτυχώς.

Microorganisms can form biofilms which are structured multicellular communities that adhere to abiotic or living surfaces. Biofilms formed by spoilage microorganisms can have significant economic consequences for the food and beverage industry. The ability to form a biofilm belongs to the phenotypic characteristics that differ between strains within the same species. Often the antimicrobial agents used are not able to destroy all the viable cells of the biofilm so a deeper understanding of the mechanism and factors that affect the formation of the biofilm is necessary in order to find new ways to deal with it. The main object of the present study was to evaluate the adhesion and biofilm ability of the wine spoilage yeast Brettanomyces bruxellensis. Adhesion ability of eleven strains was initially studied and at the same time, the metabolic fingerprint of planktonic versus adherent cells was compared using FTIR. A strain with a high spoilage potential was then selected for the in-depth study of biofilm formation. Specifically, the factors that affect adhesion, the biofilm kinetics and the possible spoilage of wine by attached cells were examined. For this purpose, different conditions (low pH, ethanol, sulfur dioxide, wine, must) and materials (stainless steel, glass) found in winemaking were evaluated as factors affecting adhesion. Stainless steel coupons were used for the biofilm growth over time and sampling took place at 0, 24, 48, 72 and 144 hours, while for the spoilage potential the "contaminated" red wine was incubated at 25oC for two months. Finally, new techniques were used to treat the adhesion of B. bruxellensis (33.1) to stainless steel coupons, such as the treatment with different concentrations of chitosan and the presence of two different commercial strains of the lactic acid bacteria Oenococcus oeni. The results showed that the examined strains of the microorganism B. bruxellensis, did not have the same adhesion capacity. FTIR analysis achieved to clearly discriminate the spectra profile of adhered vs planktonic cells of the eleven strains. All attached cells showed the same metabolic fingerprint as opposed to the planktonic ones, which showed greater variability, suggesting a possible common adherence mechanism for this species. In addition, it was observed that the stress conditions of wine affect the adhesion of B. bruxellensis (33.1), while the population of attached cells remains stable for the first five days of biofilm formation. The attached cells show a potential for spoilage, since they caused changes in the organoleptic profile of the product after 2 months in contact with fresh wine. Finally, chitosan and O. oeni cultures can be used as new ways of dealing with the biofilm formation. In conclusion, Infrared Spectroscopy (FTIR) can be applied as a method of biofilm analysis despite the possible variability of B. bruxellensis strains in adhesion capacity while new treatments are likely to be applied successfully.