Στοχαστική περιγραφή της ανάκαμψης μεμονωμένων κυττάρων Listeria monocytogenes μετά από έκθεση σε συνθήκες καταπόνησης

Abstract

Ο τροφιμογενής παθογόνος μικροοργανισμός Listeria monocytogenes, συναντάται σε ένα ευρύ φάσμα οικολογικών θώκων, περιλαμβανομένου του εδάφους, του νερού και των φυτών. Χώροι επεξεργασίας τροφίμων, μη επεξεργασμένα τρόφιμα και τρόφιμα έτοιμα προς κατανάλωση (RTE) εύκολα επιμολύνονται με τον μικροοργανισμό, μέσω φορέων. Η κατανάλωση τροφίμων, μολυσμένων με τον μικροοργανισμό, ενέχει τον κίνδυνο της λιστερίωσης, μια δυνητικά θανατηφόρο ασθένεια. Προκειμένου, να εξασφαλισθεί η ασφάλεια των τροφίμων, η Βιομηχανία Τροφίμων, δημιουργεί δυσμενείς συνθήκες για την επιβίωση του μικροοργανισμού Listeria monocytogenes, οι οποίες περιλαμβάνουν, όξινα περιβάλλοντα, προσθήκη αλάτων, υψηλές θερμοκρασίες. Το βακτήριο, ωστόσο, έχει αναπτύξει μηχανισμού, που του επιτρέπουν να επιβιώνει στις παραπάνω καταπονήσεις. Η καταπόνηση των κυττάρων του συγκεκριμένου μικροοργανισμού, ενδέχεται να επάγει την κατάσταση Ζώντα αλλά Μη Καλλιεργήσιμα (VBNC), κατά την οποία τα κύτταρα τραυματίζονται υποθανάτια, χωρίς όμως να θανατώνονται. Αυτό ενέχει την πιθανή ανάκαμψη των κυττάρων, όταν βρεθούν σε ευνοϊκές, για αυτά, συνθήκες, αποτελώντας απειλή για την ασφάλεια των τροφίμων. Στόχος της παρούσας μελέτης, είναι να διερευνήσει την κατάσταση Ζώντα αλλά Μη Καλλιεργήσιμα (VBNC) του εν λόγω μικροοργανισμού, να αξιολογήσει ποσοτικά τον υποθανάτιο τραυματισμό στα κύτταρα του μικροοργανισμού υπό συνθήκες καταπόνησης, που σχετίζονται με την επεξεργασία και περιβάλλοντα επεξεργασίας των τροφίμων και να παρακολουθήσει σε πραγματικό χρόνο την ικανότητα ανάκαμψης με την χρήση της συσκευής Bioscreen. Συγκεκριμένα, το βακτηριακό στέλεχος, ScottA (ορότυπος 4b) υποβλήθηκε σε όξινη καταπόνηση, χρησιμοποιώντας οξικό οξύ (ΑΑ) και υδροχλωρικό οξύ (HCl) και σε καταπόνηση λιμού σε συνδυασμό με προσθήκη αλατιού. Οι παράγοντες καταπόνησης διαλύθηκαν σε διάλυμα Ringer, χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα μέσης στατικής φάσης με τελικό πληθυσμό 109 CFU/ml, και οι θερμοκρασίες που μελετήθηκαν είναι 20°C και 4°C. Η επαγωγή της VBNC κατάστασης, στα κύτταρα του στελέχους ScottA του μικροοργανισμού Listeria monocytogenes, πραγματοποιήθηκε με τη χρήση οξικού οξέος (ΑΑ) pH 3, 2.7 και 2.5 στους 20°C, για 5 ώρες και υδροχλωρικού οξέος (HCl) pH 3, 2.7 και 2.5 στους 20°C, για 5 ώρες. Προκειμένου να διαφοροποιηθεί ο ανθεκτικός υποπληθυσμός από τον συνολικό, θρεπτικό μέσο Tryptic Soy Agar με 0.6% Yeast Extract (TSA-Ye) συμπληρωμένο ή όχι με 5% w/v NaCl χρησιμοποιήθηκε συγκριτικά. Τα κύτταρα VBNC προσδιορίστηκαν συγκρίνοντας τα αποτελέσματα από την μέθοδο της επιφανειακής επίστρωσης και της Μικροσκοπίας Φθορισμού, χρησιμοποιώντας συνδυασμό των φθοριζουσών χρωστικών ουσιών CFDA και Ιωδιούχο Προπίδιο PI. Σε κάθε χρονική στιγμή δειγματοληψίας αποτυπώθηκε και μία φωτογραφία από το Μικροσκόπιο Φθορισμού. Η ικανότητα της ανάκαμψης παρακολουθήθηκε σε πλάκες μικροτιτλοδότησης, που περιείχαν Tryptone Soy Broth εμπλουτισμένο με 0.6% Yeast Extract (TSB-Ye) στους 37oC, καθώς και στο θρεπτικό υπόστρωμα Tryptic Soy Agar εμπλουτισμένο με 0.6% Yeast Extract (TSA-Ye). Ο μικροοργανισμός Listeria monocytogenes, σε καμία από τις παραπάνω συνθήκες δεν έχασε την καλλιεργησιμότητά του και τα κύτταρα παρέμειναν CFDA+, εκπέμποντας πράσινο φθορισμό. Επομένως, υπό αυτές τις συνθήκες, δεν πραγματοποιήθηκε επαγωγή της κατάστασης VBNC. Ωστόσο, κατά την έκθεση σε υδροχλωρικό οξύ pH 2.7 και pH 2.5, παρατηρήθηκε υψηλός αριθμός τραυματισμένων κυττάρων (CFDA+/PI+), υποδεικνύοντας μια ενδιάμεση κατάσταση τραυματισμού, επιβεβαιώνοντας τη ύπαρξη μιας συνεχούς μεταβατικής κατάστασης λήθαργου. Επιπλέον, τα κύτταρα, στο TSB-Ye, παρουσίασαν ικανότητα ανάκαμψης, μετά την έκθεση και στα τρία διαφορετικά pH οξικού οξέος, παρουσιάζοντας τον πιο επιμηκυμένο χρόνο γενεάς σε pH 2.5 (10 ± 0,1 ώρες), συγκριτικά με τα μη καταπονημένα κύτταρα. Αντίθετα, ανάκαμψη των κυττάρων δεν παρατηρήθηκε μετά την έκθεση στο pH 2.5 οξικού οξέος (AA) σε TSA-Ye, όμως παρατηρήθηκε ανάκαμψη στα υπόλοιπα δύο pH (pH 3 και pH 2.7). Η παρούσα μελέτη εντάσσεται και θα μπορούσε να συνεισφέρει στην γενικότερη προσπάθεια της Επιστήμης Τροφίμων, στην καλύτερη κατανόηση των κινδύνων που ο υποθανάτιος τραυματισμός και η κατάσταση λήθαργου, ενέχουν για την ασφάλεια των τροφίμων.

The foodborne pathogen Listeria monocytogenes is found in a wide range of ecological fungi, including soil, water and plants. Food processing areas, unprocessed foods and ready-to-eat foods (RTE) are easily contaminated with the microorganism through vectors. Consumption of food contaminated with the microorganism carries the risk of listeriosis, a potentially deadly disease. In order to ensure food safety, the Food Industry, creates adverse conditions for the survival of the microorganism Listeria monocytogenes, which include, acidic environments, addition of salts, high temperatures. The bacterium, however, has developed stress response mechanisms, that allow it to survive the above stresses. Stressing the cells of this microorganism may induce the Viable but Non Culturable (VBNC) state, in which the cells are subleathal injured, but not dead. This involves the possible recovery of cells, when they are in favorable conditions for them, posing a threat to food safety. The aim of the present study is to investigate Viable but Non Culturable (VBNC) state of this microorganism, to quantify the subleathal injury to the cells of the microorganism under stress conditions, related to the processing and processing environments of food and to monitor the ability of recovery in Real-time, using the Bioscreen device. Specifically, the bacterial strain, ScottA (serotype 4b) was subjected to acid stress, using acetic acid (AA) and hydrochloric acid (HCl) and to starvation in combination with the addition of salt. The stress agents were dissolved in Ringer's solution, medium static phase cells with a final population of 109 CFU / ml were used, and the temperatures studied were 20 ° C and 4 ° C.

Induction of VBNC state in cells of the ScottA strain of Listeria monocytogenes was performed using acetic acid (AA) pH 3, 2.7 and 2.5 at 20° C for 5 hours and hydrochloric acid (HCl) pH 3, 2.7 and 2.5 at 20° C for 5 hours. In order to differentiate the resistant subpopulation from the total, Tryptic Soy Agar medium with 0.6% Yeast Extract (TSA-Ye) supplemented or not with 5% w/v NaCl was used comparatively. VBNC cells were determined by comparing the results from plate counts and Fluorescence Microscopy, using a combination of fluorescent dyes CFDA and Propionate Iodine PI. Each time point corresponded to a fluorescent microscope snapshot. Recovery ability was monitored on microtiter plates containing Tryptone Soy Broth enriched with 0.6% Yeast Extract (TSB-Ye) at 37 ° C, and also in Tryptic Soy Agar enriched with 0.6% Yeast Extract (TSA-Ye).

The microorganism Listeria monocytogenes did not losτ its culturability under any of the above conditions and the cells remained CFDA +, emitting green fluorescence. Therefore, under these conditions, the VBNC state was not induced. However, when exposed to pH 2.7 and pH 2.5 hydrochloric acid, a high number of injured cells (CFDA + / PI +) was observed, indicating an intermediate injury state, confirming the existence of a continuous transient state of inactivation. In addition, the cells were able to recover at all three different acetic acid pH, having the longest generation time at pH 2.5 (10 ± 0.1 hours), compared to the non-stressed cells. In contrast, cell recovery was not observed after exposure to acetic acid (AA) pH 2.5 in TSA-Ye, but recovery was observed at the other two pH (pH 3 and pH 2.7).

The present study is part of and could contribute to the overall effort of Food Science, to better understand the risks that subleathal injury and inactivation, involve to food safety.