Αξιοποίηση παραπροϊόντων άλεσης σιτηρών προς παραγωγή βακτηριακής κυτταρίνης και νανοκυτταρίνης

Abstract

Η βακτηριακή κυτταρίνη συγκαταλέγεται μεταξύ των πιο πολλά υποσχόμενων βιοπολυμερών λόγω της βιοσυμβατότητας και βιοαποικοδομησιμότητας της βρίσκοντας εφαρμογές σε πολλούς τομείς όπως τρόφιμα, χημική βιομηχανία, ιατρική και άλλα. Οι ιδιότητες της βακτηριακής κυτταρίνης είναι άρρηκτα συνδεδεμένες με το τρισδιάστατο νανοδίκτυο που σχηματίζει όπως και τις συνθήκες της ζύμωσης. Αποτελεί ένα χαρακτηριστικό εξωκυτταρικό πολυμερές που διαθέτει υψηλό βαθμό πολυμερισμού και κρυσταλλικότητας, ενισχυμένες μηχανικές ιδιότητες, θερμική σταθερότητα και υψηλή ικανότητα συγκράτησης νερού. Τροποποίηση της βακτηριακής κυτταρίνης μέσω διαφόρων μεθόδων όπως όξινη υδρόλυση προς παραγωγή νανοκυτταρίνης θα μπορούσε να προσδώσει υψηλή προστιθέμενη αξία στο βιοπολυμερές. Στην παρούσα εργασία αξιολογήθηκε, αρχικά, η δυνατότητα παραγωγής βακτηριακής κυτταρίνης χρησιμοποιώντας ως θρεπτικό υπόστρωμα ζύμωσης αμυλοπρωτεϊνούχα απόβλητα της βιομηχανίας τροφίμων και πιο συγκεκριμένα απόβλητα πιτύρου σίτου. Σε πρώτο στάδιο, πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις στερεής κατάστασης με το στέλεχος μύκητα Aspergillus awamori προς παραγωγή ακατέργαστων ενζύμων. Τα παραγόμενα ένζυμα χρησιμοποιήθηκαν ως βιοκαταλύτες για την υδρόλυση του πιτύρου σίτου προς παραγωγή θρεπτικού υποστρώματος ζύμωσης πλούσιο σε πηγές άνθρακα, αζώτου και άλλων θρεπτικών συστατικών με τελικό σκοπό την παραγωγή βακτηριακής κυτταρίνης. Πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις διαλείποντος έργου με το βακτηριακό στέλεχος Komagataeibacter sucrofermentans DSM 15973 προς παραγωγή βακτηριακής κυτταρίνης. Εξετάστηκε η επίδραση διαφορετικών τιμών pH (4,5, 5,2, 6), διαφορετικών λόγων άνθρακα προς άζωτο που περιέχονται στις ελεύθερες αμινομάδες αμινοξέων και πεπτιδίων (FAN- Free Amino Nitrogen) (C/FAN) (30, 20, 14, 10) και η παροχή αερισμού στην αποδοτικότητα της ζύμωσης. Στις βακτηριακές ζυμώσεις στις οποίες η τιμή του pH ρυθμιζόταν στο 6, επιτεύχθηκε ενισχυμένη συγκέντρωση βακτηριακής κυτταρίνης (3,2 g/L) με απόδοση ζύμωσης ίση με 0,16 g/g ολικών σακχάρων και παραγωγικότητα 0,41 g/L/ημέρα. Στην περίπτωση των διαφορετικών λόγων C/FAN, η μέγιστη παραγωγή βακτηριακής κυτταρίνης ήταν 5,2 g/L σε λόγο C/FAN ίσο με 14, με απόδοση 0,29 g/g ολικών σακχάρων και παραγωγικότητα 0,70 g/L/ημέρα. Περαιτέρω μείωση του λόγου είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση της συγκέντρωσης της βακτηριακής κυτταρίνης. Σε επόμενο στάδιο, πραγματοποιήθηκαν βακτηριακές ζυμώσεις σε στατικούς βιοαντιδραστήρες με παροχή αερισμού για την παραγωγή βακτηριακής κυτταρίνης. Η μέγιστη συγκέντρωση βακτηριακής κυτταρίνης που επιτεύχθηκε σε αυτή την περίπτωση ανήλθε σε 2,9 g/L. Η παροχή αερισμού στο περιβάλλον της ζύμωσης δεν φάνηκε να επηρεάζει ιδιαίτερα την αποδοτικότητα της ζύμωσης γεγονός το οποίο μπορεί να οφείλεται στην στροφή του βακτηριακού μεταβολισμού προς παραγωγή βιομάζας. Σε τελικό στάδιο, η βακτηριακή κυτταρίνη υδρολύθηκε με τη χρήση θειικού οξέος προς παραγωγή νανοκυτταρίνης. Τα δείγματα χαρακτηρίστηκαν ως προς τη μορφολογία (Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης (SEM)), την κρυσταλλικότητα (Φασματοσκοπία περίθλασης ακτίνων-Χ), το μέγεθος των σωματιδίων (Σκέδαση Φωτός), την απορρόφηση και εκπομπή υπερύθρου φάσματος (FT-IR), τη μέγιστη θερμοκρασία αποσύνθεσης (Θερμοσταθμική ανάλυση) και το ζ-δυναμικό. Από την ανάλυση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης φάνηκε ότι η νανοκυτταρίνη που προέκυψε μετά από 24 ώρες υδρόλυσης είχε διάμετρο 25,8-73,1 nm και αναλογία μήκους/διαμέτρου μεγαλύτερη από 13, γεγονός το οποίο δείχνει την καταλληλότητα της ως παράγοντας ενίσχυσης σε μήτρες πολυμερών. Ο δείκτης κρυσταλλικότητας της βακτηριακής κυτταρίνης προσδιορίστηκε ίσος με 81,8% ενώ της βακτηριακής κυτταρίνης μετά από υδρόλυση 24 ωρών ήταν 90,1%. Η μέγιστη θερμοκρασία αποσύνθεσης της βακτηριακής κυτταρίνης ήταν 338 °C ενώ της βακτηριακής κυτταρίνης μετά από υδρόλυση 24 ωρών ήταν ελαφρώς χαμηλότερη. Τέλος, τα φάσματα FT-IR της βακτηριακής κυτταρίνης υπέδειξαν την παρουσία των δύο Iα και Ιβ τύπου αλλόμορφων. Απαραίτητη κρίνεται η περαιτέρω μελέτη βελτιστοποίησης των ζυμώσεων προς παραγωγή βακτηριακής κυτταρίνης με σκοπό την αύξηση της παραγωγικότητας του πολυμερούς. Επιπλέον, μελλοντική έρευνα θα επικεντρωθεί στη μελέτη διαφορετικών συνθηκών υδρόλυσης της βακτηριακής κυτταρίνης με τη χρήση διαφορετικών μεθοδολογιών με στόχευση σε συγκεκριμένες εφαρμογές.

Bacterial cellulose rangs among the most promising biopolymers due to its biodegradability and biocompatibility and widespread applications in a vast number of applications including food, chemical industry and medicine. The properties of bacterial cellulose are highly dependent on the high orientation of its three-dimensional network and the conditions of the fermentative environment. Bacterial cellulose constitutes an extracellular biopolymer with high degree of polymerization and crystallinity, enhanced mechanical properties, thermal stability and water holding capacity. Modification of bacterial cellulose by various methods such as acid hydrolysis to produce nanocellulose could give high added value to the polymer. In the present study, the potential to produce bacterial cellulose from flour and starch based waste streams derived from the food industry has been evaluated. The first stage of the experimental study dealt with the production of crude enzymes via solid state fermentation with the fungus Aspergillus awamori. The enzymes were used as biocatalysts to hydrolyze wheat flour milling by-products (namely wheat bran) and produce a fermentation medium rich in carbon, nitrogen and other nutrient sources for the production of bacterial cellulose. Batch fermentations were carried out with the bacterial strain Komagataeibacter sucrofermentans DSM 15973 to produce bacterial cellulose. The effect of different pH values (4.5, 5.2, 6), different ratios of C/FAN (30, 20, 14, 10) and air sparging on bacterial cellulose production were evaluated. Fermentations with pH value of 6, resulted in enhanced bacterial cellulose concentration (3.2 g/L) with a yield of 0.16 g/g total sugars and productivity of 0.41 g/L/day. The highest concentration of bacterial cellulose (5.18 g/L) was achieved at a C/FAN ratio of 14, while conversion yield was 0.29 g/g total sugars with a productivity of 0.70 g /L/day. Further decrease of the C/FAN ratio did not favore bacterial cellulose production. Bacterial fermentations were also performed in static tray bioreactors with air sparging. The highest concentration of bacterial cellulose achieved in this case was 2.9 g/L. Fermentation efficiency was not particularly affected, probably due to the shift of bacterial metabolism to biomass production. The final stage of this experimental study involved bacterial cellulose hydrolysis with sulfuric acid to produce nanocellulose. The samples were further characterized in terms of morphology (Scanning Electron Microscope), crystallinity (X-ray diffraction), particle size (Light scattering), absorption and emission of infrared spectrum (FT-IR), maximum decomposition temperatures (TGA) and z-potential. Bacterial cellulose samples after hydrolysis, showed varying diameters (25.8-73.1 nm) with a length/diameter ratio of higher than 13, indicating their suitability as a reinforcing agent in polymeric matrices. The crystallinity index of bacterial cellulose was 81,8% while that of bacterial cellulose after hydrolysis was 90,1%. The decomposition temperature of bacterial cellulose was 338 °C, while that of bacterial cellulose after hydrolysis was slightly decreased. Finally, the FT-IR spectra of bacterial cellulose indicated the presence of Iα and Iβ type allomorphs. Future study will focus on the optimization of bacterial cellulose fermentation to increase productivity. In addition, different hydrolysis conditions of bacterial cellulose using different acids and combinations at particular ratios and different hydrolysis duration should be evaluated.