Παραγωγή ηλεκτρικού οξέος μέσω ζυμώσεων και μελέτη ηλεκτροχημικών διεργασιών στο μεταβολισμό του βακτηρίου Actinobacillus succinogenes μέσω μεταγραφομικής ανάλυσης.

Abstract

Το ηλεκτρικό ή (IUPAC) είναι ένα γραμμικό, δικαρβοξυλικό οξύ, το οποίο παραδοσιακά αποτελεί πετροχημικό προϊόν που προέρχεται από το βουτάνιο, ενώ συγκαταλέγεται στα δέκα κορυφαία χημικά παραγωγής βιοδιυλιστηρίων από τα οποία μπορεί να προκύψει πλήθος άλλων απλών ή σύνθετων ενώσεων. Η παρούσα εργασία στοχεύει στη βιοτεχνολογική παραγωγή του ηλεκτρικού οξέος μέσω ζύμωσης με το βακτήριο Actinobacillus succinogenes, μέσω του αναγωγικού κύκλου του Krebs. Στην παρούσα ερευνητική μελέτη εξετάστηκε η επίδραση του MgCO3 και του ηλεκτρικού ρεύματος στο μεταβολισμό του βακτηρίου A. succinogenes. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε σειρά ζυμώσεων για την αξιολόγηση της παραγωγής ηλεκτρικού οξέος και παραπροϊόντων. Οι ζυμώσεις αυτές ήταν ασυνεχείς και ημισυνεχείς με προσθήκη MgCO3, αλλά και ημισυνεχείς με προσθήκη MgCO3 και παροχή ρεύματος. Κατά την εκθετική φάση των ημισυνεχών ζυμώσεων συλλέχθηκαν δείγματα για απομόνωση RNA και σύνθεση cDNA τα οποία αξιοποιήθηκαν στη μέθοδο της ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (RT-qPCR). Συγκεκριμένα, μελετήθηκαν τα γονίδια του κωδικοποιούν για τα ένζυμα που παίρνουν μέρος στις μεταβολικές αντιδράσεις του κύκλου των τρικαρβοξυλικών οξέων (TCA cycle), αυτά τις οξειδωτικής φωσφορυλίωσης και ορισμένα που κωδικοποιούν για διαμεμβρανικούς μεταφορείς. Τα σχετικά επίπεδα μεταγραφής των γονιδίων ενδιαφέροντος υπολογίστηκαν με βάση τη συγκριτική μέθοδο Ct (ή ΔCt) και εκφράστηκαν ως λόγος ΗΚ γονιδίων προς το γονίδιο ενδιαφέροντος. Οι ζυμώσεις στις οποίες το βακτηριακό στέλεχος A. succinogenes 130Z (DSM 22257) αναπτύχθηκε υπό την παροχή ηλεκτρικής ενέργειας στο υγρό θρεπτικό μέσο της ζύμωσης (Ε) είχαν την υψηλότερη τελική συγκέντρωση ηλεκτρικού οξέος, 36,4 g/L, έναντι 33,94 g/L όταν δε χρησιμοποιήθηκε το ρεύμα (G+). Τόσο η μεμονωμένη προσθήκη MgCO3 όσο και η μεμονωμένη παροχή ηλεκτρικής ενέργειας στο υγρό θρεπτικό μέσο της ζύμωσης βελτίωσαν την παραγωγή του ηλεκτρικού οξέος. Η συνεργιστική τους δράση δε φαίνεται να διαφοροποιεί τα τελικά αποτελέσματα. Στις ασυνεχείς ζυμώσεις, η τελική συγκέντρωση του ηλεκτρικού οξέος ήταν 19,96 g/L. Τα αποτελέσματα των ασυνεχών ζυμώσεων συγκρίθηκαν με ζυμώσεις που πραγματοποιήθηκαν στις ίδιες συνθήκες και με ίδιες αρχικές συγκεντρώσεις πηγής άνθρακα, αζώτου και αλάτων, αλλά χωρίς την προσθήκη MgCO3 (G+). Η παραγωγή ηλεκτρικού οξέος ήταν μεγαλύτερη όταν χρησιμοποιήθηκε το MgCO3 και ο χρόνος που διήρκησε η ζύμωση μικρότερος, με αποτέλεσμα αυξημένη παραγωγικότητα (0,5 g/L·h). Σε γονιδιακό επίπεδο, η σύγκριση της σχετικής έκφρασης των γονιδίων στους χειρισμούς G- και G+ φανέρωσε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των γονιδίων pk, pdh E2, ak, atp F1a, atp F1b, atp F1g. Τα προαναφερθέντα, πλην του atp F1b και με την προσθήκη του cyd I, ήταν τα γονίδια που είχαν στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των χειρισμών G- και Ε. Με εξαίρεση το γονίδιο pk, που ήταν υπερεκφρασμένο στο χειρισμό G+ και υποεκφρασμένο στον χειρισμό E έναντι του G-, η σχετική έκφραση των υπολοίπων γονιδίων μειώθηκε τόσο στο G+ όσο και στο E. Ωστόσο, η συνεργιστική δράση του ηλεκτρικού ρεύματος και του MgCO3 δε φαίνεται να διαφοροποιεί αρκετά τα τελικά αποτελέσματα από εκείνα που ελήφθησαν όταν χρησιμοποιήθηκε μόνο το MgCO3.

Succinic acid or 1,4-butanedioic acid (IUPAC) is a linear, saturated, dicarboxylic acid, deriving from butane when it is produced by the petrochemical industry. It is also one of the top ten biorefinery chemicals from which many other chemicals can be produced. In this work, succinic acid was produced via microbial fermentations, through the reverse Krebs cycle, utilizing the bacterium Actinobacillus succinogenes. In this study, the effect of MgCO3 and electricity on the metabolism of A. succinogenes were investigated. Initially, a series of fermentations were performed to evaluate the succinic acid and by-product production. These were batch and fed-batch fermentations with the addition of MgCO3, while in the case of fed-batch fermentations both MgCO3 was added and electricity was supplied. Samples for RNA isolation and cDNA synthesis were collected during the exponential phase of the fed-batch fermentations and they were used in the real time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) method. In particular, genes encoding for enzymes involved in the tricarboxylic acid (TCA) cycle, oxidative phosphorylation and some transporters in particular, have been studied. The relative expression levels of the genes of interest were calculated based on the comparative Ct (or ΔCt) method and they were expressed as the ratio of the HK genes to the gene of interest. When A. succinogenes 130Z (DSM 22257) fermentations were carried out with the supply of electrons (E), the highest final succinic acid concentration of 36,4 g/L was obtained, while 33,94 g/L succinic acid was produced when no electricity (G+) was used. The individual addition of MgCO3 or the supply of electrons to the fermentation broth improved succinic acid production. Their joined effect does not seem to significantly differentiate the final results. In batch fermentations, the final concentration of succinic acid was 19,96 g/L. The results of batch fermentations were compared with fermentations carried out under the same conditions and the same initial concentrations of carbon, nitrogen and salts, but without the addition of MgCO3 (G+). The production of succinic acid was higher when MgCO3 was used and the fermentation duration was shorter, resulting in increased productivity (0,50 g/L·h). Regarding the transcriptomic analysis, the comparison of the relative expression of the genes in the G- and G+ treatments revealed a statistically significant difference in pk, pdhE2, ak, atpF1a, atpF1b, atpF1g. The previously mentioned genes, with the exception of atpF1b and the addition of cyd I, had a statistically significant difference between the Gand E treatments. Excluding the pk gene, which was overexpressed in G+ treatment and underexpressed in E versus G- treatment, the relative expression of the remaining genes decreased in both G+ and E treatments. The joined effect of electricity and MgCO3 does not seem to significantly differentiate the final results when compared with the effect incurred via solely MgCO3 addition.