Η ενδοκυτταρική επιλεκτική πρωτεόλυση αποτελεί ένα σημαντικό μετα-μεταφραστικό ρυθμιστικό μηχανισμό διατήρησης της πρωτεϊνικής ομοιόστασης, μέσω της αφαίρεσης μη-λειτουργικών, κατεστραμμένων ή τοξικών πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων. Η ATP-εξαρτώμενη LON πρωτεάση κατέχει πρωταγωνιστικό ρόλο κατά τον ποιοτικό έλεγχο των πρωτεϊνών. Παρά όμως την υψίστης σημασίας δράση της, ιδίως στη διατήρηση της μιτοχονδριακής ομοιόστασης και την πολύχρονη μελέτη της συγκεκριμένης πρωτεάσης, πολύ λίγα είναι γνωστά για τον τρόπο λειτουργίας της και την επιλογή των υποστρωμάτων της. Η διεξαγωγή in vivo πειραμάτων παγίδας υποστρωμάτων-στόχων του συστήματος LON μέσω της χρήσης ανενεργών καταλυτικά LON πρωτεασών και η συγκριτική μελέτη των ανωτέρω, θα συμβάλει στην αποσαφήνιση του ειδικού ρόλου της συγκεκριμένης πρωτεάσης κατά τον ποιοτικό έλεγχο των πρωτεϊνών.
Ο σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η δημιουργία διαγονιδιακής κατασκευής η οποία θα οδηγεί στην έκφραση μίας πρωτεολυτικά ανενεργής ισομορφής της πρωτάσης LON1 στο φυτό Arabidopsis thaliana. Συγκεκριμένα, δημιουργήθηκε η κατασκευή pLON1::LON1trap-FLAG μέσω τεχνικών μοριακής κλωνοποίησης. Το διαγονίδιο lon1trap φέρει τις μεταλλάξεις S(841)A & K(884)A στην καταλυτική δυάδα του πρωτεολυτικού κέντρου της LON1 ώστε να αποτρέπεται η πρωτεόλυση των πρωτεϊνών-στόχων της. Μεταλλάγματα lon1-1 και lon1-1 με έκφραση του γονιδίου αναφοράς της πρωτεΐνης GFP στα μιτοχόνδρια, τα οποία εκφράζουν μία μη λειτουργική ισομορφή της πρωτεάσης LON1, μετασχηματίστηκαν μέσω μεθοδολογίας σταθερού μετασχηματισμού με την παραπάνω κατασκευή. Στη συνέχεια, ακολούθησαν βιομετρικές αναλύσεις μήκους πρωτογενούς ρίζας στους απογόνους της Τ2 γενιάς μετασχηματισμένων φυτών. Η έκφραση της LΟΝ1trap επιβεβαιώθηκε στις επιλεγμένες σειρές μετασχηματισμένων φυτών μέσω της τεχνικής ανοσοαποτύπωσης πρωτεϊνών-Western Blot.
Ο πειραματικός σχεδιασμός περιλαμβάνει όλες τις απαραίτητες παραμέτρους για τη δημιουργία επιτυχούς συστήματος παγίδας υποστρωμάτων-στόχων της LON1 πρωτεάσης όπως, τη χρήση ενδογενούς προαγωγέα LON1, τη σήμανση της LON1trap και το γενετικό υπόβαθρο στο οποίο η LON1 είναι μη λειτουργική. Τα αποτελέσματα των βιομετρικών αναλύσεων, φανερώνουν ότι η LΟΝ1trap, ίσως να διατηρεί την ικανότητά της ως μοριακός συνοδός αναστρέφοντας κατά το ήμισυ τον επιβαρυμένο φαινότυπο των lon1-1 φυτών. Επιπλέον, η ύπαρξη του γονιδίου αναφοράς της πρωτεΐνης GFP στο γενετικό υπόβαθρο μετασχηματισμένων φυτών, φαίνεται να επιβαρύνει περαιτέρω την ομοιόσταση των μιτοχονδρίων σε ορισμένες σειρές φυτών, οδηγώντας στο φαινόμενο της μιτοχονδριακής όρμησης. Η κατανόηση του μοριακού μηχανισμού άμυνας των φυτικών οργανισμών έναντι των περιβαλλοντικών αλλαγών με την δράση της πρωτεάσης LON, αναμένεται να συνεισφέρει στη διασφάλιση της πρωτογενούς παραγωγής. H χρήση των in vivo συστημάτων παγίδας υποστρωμάτων είναι η ιδανική πειραματική στρατηγική για την κατανόηση της λειτουργίας του συστήματος Lon στις παραπάνω μοριακές διεργασίες.
Intracellular selective proteolysis is an important post-translational regulatory mechanism maintaining protein quality control by removing defective, damaged or even deleterious protein aggregates. ATP-dependent LON protease plays a crucial role in the protein quality control. However, despite the high importance of LON’s action, especially concerning the maintenance of mitochondrial homeostasis -as well as the long-term study of this protease- there are not accurate information about how it functions and how it recognizes its substrates. Conducting in vivo trap experiments of LON’s substrate targets using catalytically inactive LON proteases and the comparative study of the above, will help to understand the specific role of this protease in the protein quality control.
The aim of this thesis is the creation of a transgenic construct that will lead to the expression of a proteolytically inactive isoform of protease LON1 in the plant Arabidopsis thaliana. We create the construct pLON1::LON1trap-FLAG through molecular cloning techniques. The lon1trap transgene carries the mutations S(841)A & K(884)A in the catalytic dyad of LON1’s proteolytic site, with the aim of preventing LON1 proteolysis. The mutants lon1-1 and lon1-1 expressing GFP protein in mitochondria, express a non-functional isoform of LON1. The above mutants were used as a genetic background for stable transformation with the construct carrying the transgene lon1trap. This was followed by biometric analyzes of primary root length in the offspring of the T2 generation of transformed plants. The expression of LON1trap was confirmed in selected plant lines by Western Blot immunoblotting technique.
The experimental design includes all the necessary parameters for the creation of a successful substrate trap. This refers to the use of an endogenous LON1 promoter, the tagging of LON1trap with FLAG and the use of a genetic background in which LON1 is non-functional. The biometric analyzes results show that LON1trap seems to maintain its ability to function as a chaperone by reversing in half the aggravated phenotype of lon1-1 plants. In addition, the presence of GFP protein in the genetic background of transformed plants appears to further aggravate mitochondrial homeostasis in some plant lines, leading to the phenomenon of Mitochondrial Hormesis (Mitohormesis). The understanding of the molecular defense mechanisms in plants via LON’s action, is expected to contribute to primary production. The use of in vivo trapping is the ideal experimental strategy for exploring the Lon proteolysis system in the above molecular processes.
