Αξιολόγηση της ποιότητας, ασφάλειας και αυθεντικότητας του κρέατος με ταχείες μεταβολομικές μεθόδους

Abstract

Οι ως τώρα έλεγχοι ασφάλειας, ποιότητας και αυθεντικότητας αφορούν πολύπλοκες τεχνικές, οι οποίες κατά γενική ομολογία είναι χρονοβόρες, δίνουν ετεροχρονισμένα αποτελέσματα και συχνά μεροληπτικά. Στα πλαίσια εκπόνησης της παρούσης διδακτορικής διατριβής με σκοπό να συναντηθούν οι ως άνω επιτηρήσεις σε εύλογο χρονικό διάστημα, αξιοποιήθηκε το μεταβολικό προφίλ (metabolomics), όπως αυτό προκύπτει από τις αναλυτικές πλατφόρμες: (α) Αέρια Χρωματογραφία συζευγμένη με Φασματομετρία Μάζας σε συνδυασμό με μικροεκχύλιση στερεής φάσης (HS/SPME-GC/MS), (β) ηλεκτρονική μύτη (e-nose), και (γ) Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (HPLC) σε συνδυασμό με κλασσική μικροβιολογία και πολυμεταβλητή στατιστική. Στις περιπτώσεις που το ερώτημα ήταν «μικροβιολογικής φύσεως» τα δεδομένα των αισθητήρων συσχετίστηκαν με τις μικροβιακές αποκρίσεις. Σε εκείνες που αφορούσε ζητήματα αυθεντικότητας/νοθείας συσχετίστηκαν με τα μεταδεδομένα. Στο “Κεφάλαιο 2”, δείγματα κιμά (βόειος, χοιρινός, ανάμικτος: 70/30% βόειος/χοιρινός) συλλέχτηκαν τυχαία κατά τη διετή επισκόπηση απο μεγάλη βιομηχανική μονάδα της Αθήνας. Τα δείγματα αναλύθηκαν μικροβιολογικά και με GC/MS, όπου και αναπτύχθηκε μια επικυρωμένη μέθοδος για την αυθεντικότητα του κιμά με βάση το πτητικό προφίλ. Η Ανάλυση σε Κύριες Συνιστώσες (PCA) χρησιμοποιήθηκε για την απεικόνιση τυχόν ομαδοποίησεων. Εν συνεχεία η Ταξινόμηση Μερικών Ελαχίστων Τετραγώνων (PLS-DA) εφαρμόστηκε για να ταξινομήσει τα δείγματα και να συσχετίσει τις μεταβλητές με τις αντίστοιχες κατηγορίες κρέατος. Το σύνολο των δεδομένων χωρίστηκε 70/30% για βαθμονόμηση (70%) και έλεγχο του μοντέλου (30%) αντίστοιχα. Κατά τη βαθμονόμηση το 99, 100 και 100% των δειγμάτων ταξινομήθηκαν ορθά ως βόεια, χοιρινά και ανάμικτα αντίστοιχα, ενώ κατά τον έλεγχο τα αντίστοιχα ποσοστά ήταν 100, 100 και 95%. Και στα δύο υποσύνολα δεδομένων, η ΣΟΤ ανήλθε σε 99% κατά μέσο όρο. Εν συνεχεία, αναδείχτηκαν οι σημαντικές μεταβλητές (πτητικές ουσίες) κατά τη ταξινόμηση και συσχετίστηκαν με τις επιμέρους κατηγορίες κρέατος. Τέλος, αξιολογήθηκε η επίδραση της εποχής δειγματοληψίας, καθώς επίσης η ημέρα παρασκευής κιμά από τη σφαγή στο πτητικό προφίλ. Στο «Κεφάλαιο 3» για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία διερευνήθηκε η μικροβιολογική και μεταβολομική (HPLC και GC/MS) σύσταση φιλέτων αλόγου κατά την συντήρηση σε παραδοσιακή συσευασία στους 0, 5, 10, και 15οC. Προέκυψε πως η μικροβιακή συσχέτιση πλησιάζει τα υπόλοιπα κόκκινα κρέατα, με αξιοσημείωτη υψηλή παρουσία Ζυμών και Μυκήτων. Υπολογίστηκε κατ’ εκτίμηση η εμπορική διάρκεια ζωής 263, 177, 92, 59 και 254, 169, 90, 58 ώρες βάσει της ΟΜΧ και ψευδομονάδων για τους 0, 5, 10, και 15οC αντίστοιχα. Αξιολογήθηκε η μικροβιολογική κατάσταση αναπτύσσσοντας μοντέλο παλινδρόμησης με μηχανές διανυσμάτων υποστήριξης (SVM-R) για πρόβλεψη της ΟΜΧ, όπου και υπολογίστηκε συντελεστής συσχέτισης 0,915 και 0,910 και RMSE 0.88 και 0.89 κατά την εκμάθηση με στους 0, 5 και 15oC και έλεγχο στους 10οC αντίστοιχα. Όσον αφορά τα HPLC αποτελέσματα, η συγκέντρωση του προπιονικού, μυρμηγκικού, γαλακτικού, και ηλεκτρικού οξέος μειιώθηκε κατά την αερόβια συντήρηση αλογίσιων φιλέτων. Παράλληλα, το οξικό, κιτρικό, βουτυρικό και ισοβουτυρικό οξύ αυξήθηκαν. Όσον αφορά το πτητικό προφίλ, η κορυφή της πεντανάλης, εξανάλης, οκτανάλης, εννεανάλης, δεκανάλης συσχετίστηκε θετικά με τα φρέσκα δείγματα, καθώς το διακετύλιο, ακετοϊνη, επτάν-2-όνη, οκτάν-2-όνη, εξανοϊκό οξύ, 3-&2-μέθυλο-βουτανόλη, και 3-μέθυλο-βουτανάλη με τα δείγματα με > 7,2 log10CFU/g. Tέλος, η εξανάλη, πεντανόλη, και 1-οκτέν-3-όλη συσχετίστηκαν θετικά με δείγματα με ΟΜΧ > 4,6 και < 7,2 log10CFU/g. Κατά το «Κεφάλαιο 4», στείρα (St) και φυσικά επιμολυσμένα (NC) μοσχαρίσια φιλέτα, συντηρήθηκαν αερόβια στους 2, 8 και 15 °C και αναλύθηκαν μικροβιολογικά ως προς την ΟΜΧ και ως προς τους επιμέρους μικροβιακούς μεταβολίτες (χρησιμοποιώντας HS/SPME-GC/MS και HPLC-PDA-RI). Η ανάλυση του βιοχημικού μονοπατιού, κατέδειξε σημαντικά μονοπάτια κατά τη συντήρηση: κύκλος κιτρικών, γλυκόλυση, μεταβολισμός πυρουβικού, μεταβολισμός δικαρβοξυκλικών, μεταβολισμός αμινοξέων. Οι ουσίες 3-&2-μεθυλο-1-βουτανόλη, 3-& 2-μεθυλο-1-βουτανάλη, 2-μεθυλο-1-προπανάλη, βουταν-2-όνη, πενταν-2-όνη, επταν-2-όνη, εννεαν-2-όνη, κιτρικό, οξικό και βουτυρικό οξύ αναδείχτηκαν ως δυνητικοί μικροβιακοί μεταβολίτες στο κρέας και συσχετίστηκαν με την αλλοιωμένη κατηγορία. Η Συνολικά Ορθή Ταξινόμηση (ΣΟΤ%) κατά τη Διακριτική ανάλυση Μερικών Ελαχίστων Τετραγώνων (PLS-DA) μεταξύ NC και S ήταν 100, 88 και 100% κατά την επαλήθευση για HPLC, GC/MS και συζευγμένο σύνολο δεδομένων. Τα αποτελέσματα του SVM-R μοντέλου απέδωσε τιμές για τη ρίζα μέσου τετραγωνικού σφάλματος (RMSE) 0,84, 0,74 και 0,58 κατά την εκμάθηση στους 2 και 15οC και 0,95, 0,99 και 0,82 κατά τον έλεγχο στους 8oC για HPLC, GC/MS και συζευγμένο σύνολο δεδομένων αντίστοιχα. Παράλληλα, η δυναμική της αλλοίωσης των στελεχών Serratia liquefaciens Β293 και Hafnia alvei Β295 μελετήθηκε in situ σε επιμολυσμένα φιλέτα υπό αερόβια συντήρηση στους 4 και 10oC και αναλύοντας με HS/SPME-GC/MS, HPLC-PDA-RI και HATR/FTIR (φασματοσκοπία υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier). Οι παραπάνω ενώσεις, συν οξικός ισοαμυλεστέρας, μεθανοθειόλη, 2,3-βουτανοδιόλη, βενζολοακεταλδεϋδη και βενζαλδεϋδη βρέθηκε ότι παράγονται από τα δύο στελέχη. Η ανάλυση βιοχημικού μονοπατιού κατέδειξε τον μεταβολισμό των πυρουβικών, κύκλο κιτρικών και τη γλυκόλυση ως τις σημαντικότερες βιοχημικές διεργασίες. Ός1ον αφορά τα FTIR αποτελέσματα, και τα δυο στελέχη είχαν υψηλές απορροφήσεις στους κυμματαριθμούς που αντιστοιχούν στα αμίδια, αμίνες, και ακόρεστες αλδεύδες και κετόνες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μεταβολομική-προσέγγιση που αναπτύχθηκε σε αυτή τη διατριβή, σε συνδυασμό με πολυμεταβλητή στατιστική ανάλυση μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν εργαλείο προκαταρκτικού ελέγχου της μικροβιολογικής κατάστασης και αυθεντικότητας του κρέατος. Υπό προϋποθέσεις, θα μπορούσε να αντικαταστήσει μερικώς τη χρονοβόρα και ετεροχρονισμένη ISO μέθοδο καταμέτρησης τρυβλίων.

So far, safety, quality and authenticity assessment involve complex techniques, which are admittedly time-consuming, provide retrospective results and often biased. Under the context of the current doctoral thesis, in order to meet the above surveillance, metabolomics through different analytical platforms: (a) solid-phase microextraction - Gas Chromatography Mass Spectrometry (HS-SPME/GC–MS), (b) electronic nose (e-nose), and (c) High Performance Liquid Chromatography (HPLC) in tandem with multivariate statistics was utilized. In cases where the question had "microbiological background" the sensor responses were correlated with the microbial data. In those cases where the task was the freshness and/or authenticity assessment, the responses were associated with the metadata. In “Chapter 2”, beef, pork and mixed (70% beef and 30% pork) minced meat samples were obtained from a large meat processing plant in Athens during a two-year survey and analyzed both microbiologically and by means of HS-SPME/GC–MS. A validated method for the authentication of raw minced meat was developed based on the volatile fingerprints. Unsupervised (PCA) and supervised (Partial Least Squares Discriminant Analysis, PLS-DA) multivariate statistical methods were applied to visualize, group and classify the samples. The data-set was splitted 70/30% for model calibration and validation respectively. During model calibration 99, 100 and 100% of the samples were correctly classified as beef, pork and mixed meat samples, respectively, while for model prediction the respective percentages were 100, 100 and 95% respectively. In both datasets, the overall correct classification rate amounted to 99% on average. Subsequently, the important variables (volatile substances) derived during classification were correlated with each meat category. Finally, the effect of sampling at different periods of the year and slaughtering to minced meat preparation on the volatilome formation was assessed. Ιn “Chapter 3”, the microbiological association and shelf-life (SL) of horse fillets during aerobic storage at isothermal conditions (0-15 °C) was investigated for first time to our knowledge. In parallel, the metabolic profile of the samples was quantified by HS-SPME/GC-MS and HPLC-PDA-RI. It was shown that the microbial association was similar to those found for other red meats, with a remarkably high presence of Yeasts and Moulds. The SL was estimated deterministically 263, 177, 92, 59 and 254, 169, 90, 58 hours for TVC and pseudomonads for 0, 5, 10, and 15 °C, respectively. Considering HPLC results, the concentration of propionic, formic, lactic and succinic acids decreased during aerobic storage of horse fillets, contrary to acetic, citric, butyric and isobutyric acid which increased. As far as the volatilome formation during aerobic storage is concerned, pentanal, hexanal, octanal, nonanal, decanal, were correlated with fresh samples, while diacetyl, acetoin, 2-heptanone, 2-octanone, hexanoic acid, 3-&2-methyl-butanol, and 3-methyl-butanal with samples with TVC>7.2 log10CFU/g. Lastly, the areas of hexanal, pentanol, and 1-octen-3-ol were correlated with samples with TVC > 4.6 and < 7.2 log10CFU/g. Herein, a support vector machine regression (SVM-R) model using data from 0, 5 and 15oC used to predict the responses of the dataset at 10oC with a correlation coefficient 0.915 and 0.910 for training and testing, respectively. In the “Chapter 4”, sterile (St) and naturally contaminated (NC) beef fillets were stored aerobically at 2, 8 and 15 °C and analyzed microbiologically for TVC and their corresponding microbial metabolites (utilizing HS/SPME-GC/MS and HPLC). The aim of the current study was to assess the microbial contribution to metabolome formation. The pathway analysis highlighted significant with great impact biochemical paths during the spoilage process. These are: citrate cycle, glycolysis, pyruvate, dicarboxylate, amino acid metabolism. Among the identified isolated compounds, 3- & 2-methyl-1-butanol, 3- & 2-methyl-1-butanal, 2-methyl-1-propanal, 2-butanone, 2-pentanone, 2-heptanone, 2-nonanone, citric, acetic and butyric acid were found to be produced from microbes and so, they were associated with the spoiled class. PLS-DA managed to discriminate accurately St and NC with an overall correct classification % 100, 88 and 100 for HPLC, GC/MS and fusion dataset respectively. Using the common and metabolic active compounds SVM-R model yielded satisfied estimated values, with Root Mean Square Error 0.84, 0.74 and 0.58 for HPLC, GC/MS, and joint datasets respectively for training at 2 and 15oC and 0.95, 0.99 and 0.82 for testing at 8oC. The spoilage potential of the strains Serratia liquefaciens B293 and Hafnia alvei B295 was examined in in-situ contaminated beef fillets under aerobic storage at 4 and 10 °C by analyzing with HPLC, GC/MS and Fourier Transform Infra-Red (FTIR). The above-mentioned compounds, except for 2-nonanone, plus isoamyl acetate, methanethiol, 2,3-butanediol, benzeneacetaldehyde and benzaldehyde were found to be produced by both strains. Considering FTIR results, both strains exhibited high intensity in the wavenumber regions corresponding to amides, amines, and unsaturated aldehydes and ketones The results indicated that the metabolomics-approach employed in this study in tandem with multivariate data analysis could be applied as a primary tool for the assessment of the microbiological condition and authenticity of raw meat. Under certain conditions it could partially substitute the time-consuming, retrospective, ISO plating method.