Μελέτη της οικοφυσιολογίας του σπόρου και του μικροπολλαπλασιασμού του Codariocalyx motorius

Abstract

Το Codariocalyx motorius (οικ. Fabaceae) (φυτό τηλέγραφος ή φυτό χορευτής) είναι ένας τροπικός θάμνος, ενδημικός της νότιας και νοτιοανατολικής Ασίας. Η κοινή ονομασία του οφείλεται στη γρήγορη ρυθμική κίνηση των φύλλων του, που δίνουν την εντύπωση ότι το φυτό λαμβάνει μηνύματα από τηλέγραφο ή ότι χορεύει, γεγονός που του προσδίδει καλλωπιστική αξία, καθώς θεωρείται ένα από τα πιο ασυνήθιστα φυτά του πλανήτη. Επιπρόσθετα, έχει και φαρμακευτική αξία λόγω των δευτερογενών μεταβολιτών που παράγει, ενώ έχει αποδειχθεί ότι τα φύλλα του έχουν ισχυρή αντιοξειδωτική δράση και βρίσκει πολλές χρήσεις στην παραδοσιακή ιατρική των χωρών που αυτοφύεται. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε αρχικά ο προσδιορισμός των κατάλληλων συνθηκών για την μέγιστη βλαστικότητα των σπόρων του. Οι σπόροι τοποθετήθηκαν για βλάστηση in vitro και ex vitro, αφού προηγήθηκαν επεμβάσεις σκαριφισμού των σπόρων μηχανικά με γυαλόχαρτο (Νο100) για 1 min ή με εμβάπτιση σε πυκνό θειικό οξύ (H2SO4) για 15 min και επιφανειακή απολύμανσή τους με 20% υδατικό διάλυμα χλωρίνης εμπορίου για 10 min. Για την βλάστηση in vitro οι σπόροι τοποθετήθηκαν σε τρυβλία Petri με θρεπτικό υπόστρωμα ½ MS, σε συνθήκες πλήρους σκότους ή σε φωτοπεριόδο 16 h, με ένταση φωτός 37,5 μmol m-2 s-1 προερχόμενη από λαμπτήρες φθορισμού, σε θερμοκρασίες 5, 10, 15, 20, 25 ή 30 οC. Οι σπόροι δεν βλάστησαν σε καμία επέμβαση στη θερμοκρασία των 5 οC. Στους 10 οC βλάστησε μόνο το 2% των σπόρων οι οποίοι είχαν σκαριφιστεί με H2SO4 και είχαν επωαστεί σε συνθήκες σκότους. Στους 15 οC βλάστησαν σπόροι όλων των μεταχειρίσεων (32-39% στους μη σκαριφισμένους σπόρους, 33-40% στους μηχανικά σκαριφισμένους και 65-82% στους σκαριφισμένους με H2SO4). Οι βέλτιστες θερμοκρασίες για την βλαστικότητα των σπόρων C. motorius ήταν οι 20 και 25 οC (56-68% για τους μη σκαριφισμένους σπόρους, 51-76% για τους μηχανικά σκαριφισμένους και 95-98% για τους σκαριφισμένους με H2SO4 σπόρους). Μείωση της βλαστικότητας παρατηρήθηκε στους 30 οC (10-47% για τους μη σκαριφισμένους σπόρους, 15-37% για τους μηχανικά σκαριφισμένους και 63-81% για τους σπόρους σκαριφισμένους με H2SO4). Συνεπώς, ο σκαριφισμός των σπόρων με H2SO4 είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του ποσοστού βλαστικότητας των σπόρων, ανεξάρτητα από τη θερμοκρασία και την φωτοπερίοδο. Όσον αφορά στην φωτοπερίοδο, η επώαση των σπόρων στο σκοτάδι είχε ως αποτέλεσμα μικρή αύξηση στο ποσοστό βλαστικότητας αλλά και στην ταχύτητα βλαστικότητας. Για την βλάστηση ex vitro οι σπόροι τοποθετήθηκαν σε φυτοδοχεία με εδαφικό υπόστρωμα τύρφης: περλίτη (1:1, v/v), είτε σε θάλαμο επώασης σταθερών συνθηκών με θερμοκρασία 25 οC είτε στο θερμοκήπιο τον Μάιο του 2020. Τόσο στο θερμοκήπιο όσο και στον θάλαμο επώασης οι σπόροι οι οποίοι είχαν σκαριφιστεί με H2SO4 βλάστησαν ταχύτερα και σε υψηλότερα ποσοστά (71%) σε σύγκριση με τους μηχανικά σκαριφισμένους (39-40%) και τους μη σκαριφισμένους σπόρους (42-52%). Διερευνήθηκε επίσης και ο μικροπολλαπλασιασμός του είδους από σπορόφυτα, με καλλιέργειες σε στερεά και υγρά υποστρώματα. Ως βασικό υπόστρωμα όλων των καλλιεργειών χρησιμοποιήθηκε το MS και μελετήθηκε η επίδραση των ΒΑ, ΚΙΝ και ΝΑΑ στη βλαστογένεση από έκφυτα κορυφής, κόμβου και κοτυλιδικού κόμβου. Όλα τα στερεά υποστρώματα στο στάδιο της αρχικής καλλιέργειας είχαν υψηλά ποσοστά αντίδρασης (67-100%), αλλά παρουσίασαν επίσης και ένα ποσοστό δύστροπων βλαστών με συμπτώματα χλώρωσης, ιδιαίτερα στα υποστρώματα τα οποία περιείχαν φυτορρυθμιστικές ουσίες (25-76%). Το ποσοστό των δύστροπων βλαστών φάνηκε να είναι ανάλογο με την συγκέντρωση της κυτοκινίνης και την παρουσία ΝΑΑ στο υπόστρωμα, ενώ σχετικά με την προέλευση του εκφύτου, τα έκφυτα κορυφής παρουσίασαν τα χαμηλότερα ποσοστά δύστροπων βλαστών και τα έκφυτα κοτυλιδικού κόμβου τα υψηλότερα. Στο στάδιο της υποκαλλιέργειας ο χρόνος επώασης των καλλιεργειών στα στερεά υποστρώματα μειώθηκε στο μισό (από 4 εβδομάδες σε 2) και επίσης μειώθηκε και η συγκέντρωση των φυτορρυθμιστικών ουσιών στο υπόστρωμα. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα την σχετική μείωση των δύστροπων βλαστών, χωρίς όμως παράλληλη αύξηση του δυναμικού πολλαπλασιασμού, αφού δεν υπήρξε μεγάλη παραγωγή βλαστών ανά έκφυτο και οι παραγόμενοι βλαστοί δεν είχαν το χρόνο να αναπτυχθούν αρκετά και να σχηματίσουν περισσότερους κόμβους. Έτσι το υψηλότερο δυναμικό πολλαπλασιασμού για τα στερεά υποστρώματα σημειώθηκε στα έκφυτα κορυφής, τα οποία επωάστηκαν για 4 εβδομάδες σε υποστρώματα εμπλουτισμένα με 0,5 mg L-1 BA (2,76). Το πρόβλημα των δύστροπων βλαστών εξαλείφθηκε κατά την καλλιέργεια σε υγρά υποστρώματα, στα οποία παρατηρήθηκαν επίσης υψηλά ποσοστά αντίδρασης (60-100%), ιδιαίτερα για τα έκφυτα κορυφής (82-100%). Ο μέσος αριθμός βλαστών ανά έκφυτο όμως δεν ήταν υψηλός σε κανένα από τα υποστρώματα, ανεξάρτητα από τον τύπο εκφύτου (1-2 βλαστοί ανά έκφυτο). Το δυναμικό πολλαπλασιασμού, παρόλο που αυξήθηκε ελάχιστα σε σχέση με τα στερεά υποστρώματα, παρέμεινε γενικά χαμηλό. Το υψηλότερο δυναμικό πολλαπλασιασμού σημειώθηκε στα έκφυτα κορυφής, τα οποία καλλιεργήθηκαν σε υγρά υποστρώματα εμπλουτισμένα με 0,5 mg L-1 BA (2,92). Μικροβλαστοί τόσο από τα υγρά όσο και τα στερεά υποστρώματα, τοποθετήθηκαν για ριζοβολία in vitro σε στερεό υπόστρωμα ½ MS, χωρίς IBA ή με προσθήκη 0,25, 0,5, 1,0 ή 2,0 mg L-1 IBA. Το υψηλότερο ποσοστό ριζοβολίας (71%) σημειώθηκε στο υπόστρωμα με 0,25 mg L-1 IBA. Τέλος, έγινε εγκλιματισμός των έρριζων φυταρίων σε ex vitro συνθήκες σε υπόστρωμα τύρφης: περλίτη (1:1, v/v), με 83% επιτυχία.

Codariocalyx motorius (Fabaceae) (telegraph plant or dancing plant) is a tropical shrub, endemic in the south and south-east Asia. It takes its common name due to the fast rhythmic movement of its leaves that give the impression that the plant is receiving messages on the telegraph or dancing, which also adds to its ornamental value, as it is considered one of the most unusual plants on the planet. Additionally, it has great pharmaceutical value due to the secondary metabolites it produces. It has also been proven that its leaves have antioxidant properties and the whole plant has many uses in the traditional medicine of the countries where it naturally grows. The first objective of the present thesis was to determine the best conditions for seed germination. The seeds were placed to germinate both in vitro and ex vitro, after mechanical scarification pretreatment with sandpaper (No100) for 1 min or chemical scarification pretreatment by submersion in condensed sulfuric acid (H2SO4) for 15 min, followed by surface sterilization with a 20% commercial bleach water solution for 10 min. Regarding in vitro seed germination, the seeds were placed to germinate in Petri dishes containing ½ MS medium, under continuous darkness or 16 h photoperiod and 37.5 m-2 s-1 fluorescent light, at 5, 10, 15, 20, 25 and 30 οC. No seeds germinated in any treatment at 5 οC. At 10 οC only 2% of the seeds that had been scarified with H2SO4 and incubated in continuous darkness germinated. At 15 οC seeds from all treatments germinated (32-39% for non-scarified seeds, 33-40% for mechanically scarified and 65-82% for seeds scarified with H2SO4). Optimum temperatures for seed germination ranged from 20 to 25 οC (56-68% for non-scarified seeds, 51-76% for mechanically scarified seeds and 95-98% for seeds scarified with H2SO4). A reduction in germination ability was observed at 30 οC (10-47% for non-scarified seeds, 15-37% for mechanically scarified and 63-81% for seeds scarified with H2SO4). Conclusively, seed scarification with H2SO4 resulted in an increase in germination ability, regardless of temperature and photoperiod. As regards to photoperiod, incubation of the seeds in continuous darkness resulted in a slight increase in germination ability, as well as germination speed. As for ex vitro germination, the seeds were placed in containers with a mixture of peat-perlite (1:1, v/v), and were incubated either in an incubation chamber at 25 οC or in the glasshouse in May of 2020. Both in the glasshouse and the incubation chamber, the seeds that had been scarified with H2SO4 germinated more rapidly and at a higher percentage (71%) compared to the mechanically scarified seeds (39-40%) and the non-scarified seeds (42-52%). Furthermore the micropropagation of the species via explants excised from young seedlings was investigated, in both solid and liquid culture media. The main medium for all in vitro cultures was MS and the effects of BA, KIN and NAA on shoot proliferation of apical, nodal and coteledonary node explants were investigated. All solid cultures produced shoots at a high percentage (67-100%), but they also produced a percentage of recalcitrant shoots, with chlorosis symptoms, especially in the media containing plant growth regulators (25-76%). This percentage of recalcitrant shoots seemed to be directly linked to the concentration of cytokinins, as well as the presence of NAA, in the media. As regards to explant origin, the apical explants formed the lowest percentage of recalcitrant shoots and the coteledonary node explants formed the highest. In the subculture stage, the culture period was reduced to half (from 4 weeks to 2) and the concentration of plant growth regulators in the media was also reduced. This resulted in a relative reduction of recalcitrant shoot formation, but it did not increase the multiplication index, since the shoot production per explant was low and the shoots did not have the necessary time to elongate and form more nodes. Thus, apical explants that were cultured in solid medium supplemented with 0.5 mg L-1 BA had the highest multiplication index (2.76). The problem of recalcitrance was eliminated in liquid culture, which also produced a high percentage of shoots (60-100%), especially for the apical explants (82-100%). The mean number of shoots per explant however remained low in all treatments, regardless of explant origin (1-2 shoots per explant). Despite a slight increase compared to the solid medium cultures, the multiplication index remained low. The highest multiplication index was observed in the apical explants that were cultured in liquid medium supplemented with 0.5 mg L-1 BA (2.92). Microshoots from both liquid and solid culture were placed for in vitro rooting in solid medium containing ½ MS, without IBA or supplemented with 0.25, 0.5, 1.0 or 2.0 mg L-1 IBA. The highest rooting percentage (71%) was shown in the medium containing 0.25 mg L-1 IBA. Ex vitro acclimatization of rooted plantlets in a mixture of peat-perlite (1:1, v/v) had an 83% success rate.