Προσδιορισμός επιβίωσης εναρκτήριων καλλιεργειών οξυγαλακτικών βακτηρίων με προβιοτικό δυναμικό κατά τη ζύμωση φυσικής μαύρης ελιάς σε άλμη μειωμένης αλατοπεριεκτικότητας με χρήση μοριακών τεχνικών

Abstract

Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επιβίωση εναρκτήριων καλλιεργειών οξυγαλακτικών βακτηρίων (Lactobacillus plantarum Β380 και Lactobacillus pentosus Β363), με εν δυνάμει προβιοτικό δυναμικό, στη ζύμωση της φυσικής μαύρης ελιάς ποικιλίας «Κονσερβολιά» με τη χρήση μοριακών τεχνικών. Από τη ζύμωση που υλοποιήθηκε στο εργαστήριο Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών, πραγματοποιήθηκε μοριακή ταυτοποίηση επιλεγμένων αποικιών με την τεχνική rep-PCR, προκειμένου να αξιολογηθεί η επιβίωση των εναρκτήριων καλλιεργειών σε επιλεγμένα χρονικά σημεία της ζύμωσης που συμπίπτουν με την έναρξη (5 ημέρες) και το τέλος της ζύμωσης (146 ημέρες). Για την ταυτοποίηση χρησιμοποιήθηκε ο γενετικός δείκτης 16S rDNA. Επιπλέον, με τη χρήση μοριακών τεχνικών ανεξάρτητων από την καλλιέργεια, πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός της μικροβιακής κοινότητας που απαντάται στον καρπό της ελιάς, στο αρχικό (5 ημέρες), ενδιάμεσο (75 ημέρες) και τελικό (146 ημέρες) στάδιο της ζύμωσης. Για την ταυτοποίηση των ζυμών χρησιμοποιήθηκε ο γενετικός δείκτης ITS2 ενώ για τα βακτήρια ο gyrB. Στην εξαρτώμενη από την καλλιέργεια μέθοδο, ταυτοποιήθηκαν τρία είδη οξυγαλακτικών βακτηρίων Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum και Leuconostoc mesenteroides. Επιπλέον, ο ενοφθαλμισμός των καλλιεργειών εκκίνησης ήταν επιτυχής καθώς κυριάρχησαν έναντι των υπόλοιπων οξυγαλακτικών βακτηρίων κατά την ολοκλήρωση της ζύμωσης. Συγκεκριμένα η παρουσία του L. plantarum Β380 παρατηρήθηκε στο 89% των βακτηριακών απομονώσεων ενώ το στέλεχος L. pentosus Β363 στο 83%. Όσον αφορά στην μεταγενετική ανάλυση, η αλατότητα της άλμης και οι καλλιέργειες εκκίνησης δεν επηρέασαν σημαντικά την μικροβιακή κοινότητα της ελιάς κατά τη ζύμωση. Αντίθετα, ο χρόνος της ζύμωσης επηρέασε σημαντικά τον πληθυσμό των ζυμών και σε μικρότερη έκταση τον πληθυσμό των βακτηρίων. Τα κυρίαρχα είδη οξυγαλακτικών βακτηρίων ήταν το L. pentosus και το L. collinoides σε όλους τους τύπους ζυμώσεων. Στη ζύμωση με καλλιέργεια εκκίνησης το βακτήριο L. plantarum, κυρίαρχο ήταν στις περισσότερες περιπτώσεις το είδος L. collinoides, το οποίο φαίνεται να παρουσιάζει καλύτερη δυναμική από το L. plantarum για να επικρατήσει στο περιβάλλον της ζύμωσης. Η παρατήρηση αυτή βρίσκεται σε αντίθεση με τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την εξαρτημένη από την καλλιέργεια μοριακή τεχνική, σύμφωνα με την οποία η καλλιέργεια εκκίνησης L. plantarum επικράτησε στο τέλος της ζύμωσης. Από την άλλη, η δυναμική της καλλιέργειας εκκίνησης L. pentosus επιβεβαιώθηκε και με τις δύο τεχνικές. Όσον αφορά στις ζύμες, κατά την ολοκλήρωση της διεργασίας παρατηρήθηκε χαμηλή ποικιλότητα με κυρίαρχο είδος το Pichia membranifaciens τόσο στην αυθόρμητη όσο και στις ελεγχόμενες ζυμώσεις

The present work aimed at studying the survival of starter cultures of lactic acid bacteria (Lactobacillus plantarum B380 and Lactobacillus pentosus B363) with probiotic potential during the fermentation of natural black Conservolia olives using molecular techniques. The fermentation process took place in the laboratory of Food Microbiology and Biotechnology of the Agricultural University of Athens. Molecular identification of selected colonies was performed by culture-dependent techniques, PCR amplification of repetitive bacterial DNA elements fingerprinting (rep-PCR) in order to evaluate the survival of the starter cultures at selected fermentation time points (5 days and 146 days). Representative isolates were selected to be identified at species level by amplifying the 16S rDNA gene sequence. In addition, using culture-independent molecular techniques, the microbiome in the olive fruit was determined at the initial (5 days), middle (75 days) and final (146 days) stage of fermentation. The ITS2 genetic marker was used to identify yeasts, while gyrB was used for bacteria. Three species of lactic acid bacteria, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum and Leuconostoc mesenteroides were identified using culture-dependent molecular techniques. In addition, inoculation of the starter cultures was successful as they dominated over the remaining lactic acid bacteria at the end of the fermentation. Specifically, the presence of L. plantarum B380 was observed in 89% of bacterial isolates, while the strain L. pentosus B363 in 83%. Regarding the metagenetic analysis, salinity and starter cultures did not affect the total microbiome of the olive samples during fermentation. On the contrary, fermentation time significantly affected the yeast population and to a lesser extent the bacteria. The predominant species of lactic acid bacteria were L. pentosus and L. collinoides in all types of inoculated fermentations. During the fermentation with L. plantarum as starter culture, L. collinoides was predominant in most cases, which seems to have better dynamics than L. plantarum, in contrast to the results of the culture-dependent molecular technique. On the other hand, the dynamics of L. pentosus were confirmed by both techniques. Regarding the yeasts, at the end of the process, low diversity was observed with Pichia membranifaciens as the dominant species, during the spontaneous as well as the controlled fermentations