Μελέτη Αλκοολικής Ζύμωσης και Ποιοτικών Χαρακτηριστικών Οίνων που παρήχθησαν με χρήση επιλεγμένων στελεχών ζυμομυκήτων

Abstract

Ο διεθνής και συνεχόμενος ανταγωνισμός στην αγορά οίνου, σε συνδυασμό με τις απαιτήσεις του καταναλωτικού κοινού για νέα, πολύπλοκα και ενδιαφέροντα προϊόντα μειωμένης αλκοόλης, έχουν δημιουργήσει στην επιστήμη της Οινολογίας, νέες προκλήσεις. Η ελεγχόμενη αλκοολική ζύμωση χωρίς την παρουσία του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae ή με το διαδοχικό εμβολιασμό του στο εν ζυμώσει γλεύκος, αποτελεί μία υποσχόμενη απάντηση σε αυτές. Επομένως, είναι σημαντική η διερεύνηση των ειδών των μικροοργανισμών, που μπορούν να συμμετάσχουν στη διαδικασία παραγωγής οίνου. Εκκινώντας από την ικανότητα των μικροοργανισμών να καταβολίσουν συγκεκριμένους υδατάνθρακες, στην παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή, επιλέγησαν τέσσερα στελέχη ζυμομυκήτων, τα οποία ερευνήθηκαν, αρχικά, ως προς την ανάπτυξή τους σε συνθετικό υπόστρωμα συγκεκριμένης ποσότητας σακχάρου (γλυκόζης) υπό αερόβιες συνθήκες (που μπορούν να χαρακτηρισθούν έως και ημιαερόβιες). Πρόκειται για τη μελέτη της βιοκινητικής συμπεριφοράς τους σε φαινόμενα ζύμωσης, με έμφαση στην επιθυμητή παραγωγή προϊόντων, όπως η αιθανόλη σε μειωμένα επίπεδα, ώστε να ευρεθούν και να μελετηθούν τα στελέχη που είναι κατάλληλα για χρήση, στην οινοποιητική διαδικασία με πιθανότητα χρήσης τους στη βιομηχανία οίνου. Ακολούθως, μελετήθηκε το φαινόμενο Crabtree, το οποίο σχετίζεται με την ικανότητα κάποιον μικροοργανισμών να εκτελούν αλκοολική ζύμωση, παρουσία οξυγόνου, όταν το σάκχαρο στο μέσο καλλιέργειας υπερβαίνει μία κρίσιμη συγκέντρωση. Έπειτα από τρεις σειρές πειραμάτων στις οποίες ακολουθήθηκαν ακριβώς οι ίδιες διεργασίες, προέκυψαν επαναλήψιμα αποτελέσματα και συμπεράσματα ως προς την ικανότητα των μικροοργανισμών να εκτελέσουν αλκοολική ζύμωση στις συνθήκες του πειράματος. Τέλος, έλαβε χώρα η μελέτη της παραγωγής των ενδοκυτταρικών πολυσακχαριτών τους και μικροβιακού λίπους. Η παρούσα διατριβή στο δεύτερο μέρος της, επικεντρώνεται στην ελεγχόμενη ζύμωση του γλεύκους με εμβόλια των ανωτέρω επιλεγμένων στελεχών ζυμομυκήτων, όπου πραγματοποιήθηκαν τέσσερεις κύκλοι πειραμαματικών μικροοινοποιήσεων με εκκινητές της ζύμωσης τους τέσσερις μικροοργανισμούς, σε παστεριωμένο γλεύκος ασύρτικο και μη, μελετώντας εκ νέου τη βιοκινητική τους σε παστεριωμένο γλεύκος αυτή τη φορά. Στη συνέχεια, οι τρεις άγριες ζύμες χρησιμοποιήθηκαν ως εμβόλιο-εκκίνσης σε διαδοχικό εμβολιασμό με τον Saccharomyces cerevisiae rhone σε παστεριωμένο γλεύκος υπό ασηπτικές συνθήκες, αλλά σε δεύτερο πλάνο και μη παστεριωμένο γλεύκος με κανονικές συνθήκες οινοποίησης. Τα επιλεγμένα στελέχη ζυμομυκήτων που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα ακόλουθα: Metschnikowia pulcherrima MPLFMB1, Hanseniaspora uvarum OSTIBFW1, Hanseniaspora guilliermondii OSPIBFW12 και Saccharomyces cerevisiae rhone. Οι τρεις πρώτοι ειναι non-Saccharomyces ζυμομύκητες, ενώ ο τέταρτος είναι σακχαρομύκητας. Θετικοί ως προς το φαινόμενο Crabtree αποδείχθηκαν οι εξής: ο πρώτος (M.pulcherrima), ο τρίτος (H.guilliermondii) και ο σακχαρομύκητας (S.cerevisiae), επαληθεύοντας τις βιβλιογραφικές αναφορές. Στην πρώτη σειρά πειραμάτων το υπόστρωμα αποτελούταν από γλυκόζη 70g/L και στο δεύτερο μέρος η αλκοολική ζύμωση πραγματοποιήθηκε σε γλεύκος ασύρτικο με ≈250g/L σακχάρων, το οποίο επιλέχθηκε κυρίως λόγω της υψηλής περιεκτικότητάς του σε σάκχαρα, ώστε να μπορούν να εξαχθούν ρεαλιστικά αποτελέσματα που να ανταποκρίνονται στην επίλυση των προκλήσεων που αντιμετωπίζει η βιομηχανία οινοποίησης παγκοσμίως. Η μελέτη κατανάλωσης των σακχάρων με ταυτόχρονη παραγωγή προϊόντων, όπως αιθανόλη, γλυκερόλη κ.ά. έλαβε χώρα μεσω HPLC. Τέλος, πραγματοποιήθηκε αξιολόγηση του πτητικού προφίλ των παραγόμενων πειραματικών οίνων ποικιλίας ασύρτικο μέσω GC-MS και οσφρητικού οργανοληπτικού ελέχου. Η αξιολόγηση αφορά τα τρία τελικά προϊόντα, τα οποία προέκυψαν ως αποτέλεσμα του διαδοχικού εμβολιασμού του οίνου με διαφορετικές άγριες ζύμες και τον ίδιο σακχαρομύκητα και κατα πόσο ο κάθε ένας από αυτούς τους διαδοχικούς εμβολιασμούς μπορεί να επηρεάσει το χαρακτήρα του οίνου (συγκέντρωση αιθανόλης, γλυκερόλης και αρωματικών ενώσεων). Η ανάλυση, συνεπώς του αρώματος των παραγόμενων πειραματικών οίνων της ποικιλίας ασύρτικο, διαφοροποιώντας την ανωτέρω παράμετρο, κρατώντας τις υπόλοιπες συνθήκες σταθερά ίδιες, αποτελεί απαραίτητη γνώση για τους οινολόγους, τόσο ως εργαλείο αξιολόγησης των ποικιλιακών οίνων, όσο και ως ένα σημαντικό βοήθημα για την επιλογή των ζυμών που θα εφαρμόσουν κατά την διαδικασία της οινοποίησης. Γενικά, παρατηρήθηκε σχετικά μικρή μείωση και στους τρεις διαφορετικούς παραγόμενους πειραματικούς οίνους (6 συνολικά δείγματα – τα 3 είναι επαναληπτικά), όσον αφορά στη σύγκριση μεταξύ του οίνου αναφοράς παραγόμενου από παστεριωμένο γλέυκος και αύξηση κυρίως των παραπροϊόντων, όπως η γλυκερόλη. Επομένως, αυτό το οποίο, ήταν το κυρίως ζητούμενο επιτεύχθει. Μεγαλύτερη μείωση παρουσίασε το δείγμα οίνου με εμβόλιο εκκίνησης M.pulcherrima. Σε δεύτερη βάση, το αρωματικό προφίλ του ασύρτικου μελετήθηκε μέσω του προσδιορισμού των πτητικών ενώσεων των πειραματικών οίνων, οι οποίες και διαμορφώνουν το άρωμα, ενώ ως πιο διαδεδομένη τεχνική για την ταυτοποίηση και ημιποσοτικοποίηση των συστατικών αυτών χρησιμοποιήθηκε η αέρια χρωματογραφία σε συνδιασμό με την φασματομετρία μάζας (Gas Chromatography/Mass Spectrometry, GC/MS). Η αξιολόγηση ολοκληρώθηκε με τον οσφρητικό οργανοληπτικό έλεγχο που έλαβε χώρα στο εργαστήριο Οινολογίας του ΓΠΑ. Η σύγκριση ανάλυσης των πτητικών ενώσεων των πειραματικών οίνων πραγματοποιήθηκε μεταξύ των δειγμάτων διαδοχικού εμβολιασμού, του αρχικού γλεύκους και βιβλιογραφικά, όχι με τον οίνο αναφοράς. Ως καλύτερο δείγμα, επιλέγεται αυτό που παράχθηκε με διαδοχικό εμβολιασμό M.pulcherrima και S.cerevisiae, λόγω κυρίως της μεγαλύτερης συγκέντρωσης επιθυμητών εστέρων σε αυτό.

The international and continuous competitiveness in the wine market, combined with the demands of the consumer public for new, complex and interesting products of low alcohol, have created new challenges in the science of Oenology. Controlled alcoholic fermentation without the presence of the microorganism Saccharomyces cerevisiae or with its sequential inoculation into the fermented must, is a promising response to them. Therefore, it is important to investigate the types of microorganisms that may be involved in the winemaking process. Starting from the ability of microorganisms to catabolize specific carbohydrates, in this master's thesis, four yeast strains were selected, which were initially investigated for their growth on a synthetic substrate of a certain amount of sugar (glucose) under aerobic or semi-aerobic conditions. The study of their biokinetic behavior in fermentation phenomena, with emphasis on the desired wine products, such as ethanol at reduced levels, in order to find and study the strains that are suitable for use, in the winemaking process with the possibility of their use in the wine industry. Next was studied, the Crabtree effect, which is related to the ability of some microorganisms to perform alcoholic fermentation in the presence of oxygen, when the sugar in the substrate exceeds a critical concentration. After three series of experiments in which exactly the same processes was followed, reproducible results and conclusions were obtained regarding the ability of microorganisms to perform alcoholic fermentation under the conditions of the experiment. Finally, the study of the production of their intracellular polysaccharides and microbial fat took place. This report, in its second part, focuses on the controlled fermentation of grape must with vaccine-cultivations of the above selected yeast strains, where four cycles of experimental micro-vinifications were carried out /took place with starters of the fermentation the four microorganisms, in pasteurized and non must. The three wild yeasts/ non-Saccharomyces were then used as a starter-vaccine culture in a sequential inoculation with Saccharomyces cerevisiae rhone in pasteurized must under aseptic conditions, but also unpasteurized must under normal vinification conditions. The selected yeast strains used are the following: Metschnikowia pulcherrima MPLFMB1, Hanseniaspora uvarum OSTIBFW1, Hanseniaspora guilliermondii OSPIBFW12 and Saccharomyces cerevisiae rhone. The first three are non-Saccharomyces yeast, while the fourth is Saccharomyces. All, except Hanseniaspora uvarum, proved to be positive for the Crabtree phenomenon, verifying the bibliographical reports. In the first series of experiments the substrate consisted of glucose ≈70g / L and in the second part the alcoholic fermentation was carried out in assorted must with ≈250g / L sugars, which was chosen mainly due to its high sugar content, so that realistic results could be obtained to meet the challenges facing the wine industry worldwide. Furthermore, the study of the consumption of sugars with simultaneous production of main and byproducts, such as ethanol, glycerol, etc. took place via HPLC. Finally, the aromatic profile of the experimental produced wines “assyrtiko” was evaluated through GC-MS and olfactory organoleptic examination. The evaluation concerns the three final products, which emerged as a result of the successive vaccination with different wild yeast and the same Saccharomyces, whether each of these successive vaccinations can affect the character of the wine (ethanol, glycerol and aromatic compounds-odor/final scent). Therefore, the analysis of the aroma of the produced experimental wines of the variety Assyrtiko, differentiating the above parameter, keeping the other conditions consistently the same, is a necessary knowledge for oenologists, both as a tool for evaluating varietal wines, and as an important aid for the selection of the doughs to be applied during the winemaking process. In general, there was a relatively small decrease in all three different experimental wines produced (6 samples in total - 3 are repetitive), in terms of comparison between pasteurized reference wine and the increase mainly in by-products, such as glycerol. Therefore, this, which was the main goal to be achieved. The wine sample with M.pulcherrima starter vaccine showed the greatest reduction in ethanol. Specifically, the aromatic profile of assyrtiko was studied by determining the volatile compounds of the experimental wines, which form the aroma, while the most common technique for the identification and semi-quantification of these components carried out via gas chromatography in combination with mass spectrometry (Gas Chromatography / Mass Spectrometry, GC / MS). The evaluation was completed with the organoleptic examination that took place in the laboratory of Oenology at AUA. The comparison of the analysis of the volatile compounds of the experimental wines was carried out between the samples of sequential inoculation, the initial must and bibliographically, not with the reference wine. As the best sample, characterized the wine which was produced by sequent inoculation of M.pulcherrima and S.cerevisiae, mainly due to the higher concentration of desired esters in it.