Characterization of spoilage microbiota through next-generation sequencing and application of spectroscopy-based technologies for assessing the microbiological quality of fresh-cut produce

Abstract

Fresh-cut produce satisfies the ever-growing consumers’ need for healthy and convenient foods. However, the naturally occurring microbial populations along with further microbial contamination during the processing tend to limit the shelf-life of these products. Given that there is limited knowledge of the microbial communities associated with spoilage of these products, the finer characterization of the fresh-cut produce microbiota, and monitoring of the impact of important environmental factors on its composition during storage is needed. On the other hand, the establishment of rapid and effective methods for microbiological spoilage evaluation also is of great importance to the fresh-cut food industry. The two main objectives of the present thesis were: i) to characterize the microbial communities associated with spoilage of these commodities during storage at different temperatures, using a metagenetic approach, (Section A: Chapters 2 and 3), and ii) to evaluate the microbiological spoilage of different fresh-cut produce commodities using rapid spectroscopy-based technologies (Section B: Chapters 4, 5 and 6). Concerning Chapter 2, the fungal and bacterial communities associated with the spoilage of ready-to-eat (RTE) pineapple during storage at different temperatures were characterized using the ITS2 and gyrB metagenetic sequencing, respectively. Significant variability in fungal species composition was observed among the different batches of RTE pineapple. The initial microbiota composition was the main influencing factor determining the progress of spoilage. Depending on the initial prevalent fungal species, the temperature’s and storage time’s impact varied. With reference to the subdominant bacterial communities, neither temperature nor batch significantly influenced the bacterial diversity and composition. In Chapter 3, a metagenetic amplicon approach, based on gyrB sequencing, was applied for deciphering the bacterial communities associated with the spoilage of RTE rocket and baby spinach stored at different temperature conditions. The vegetable communities differed in the dominance of specific bacterial species. Specifically, Pseudomonas viridiflava was dominant in most samples of rocket, while a new Pseudomonas species, as well as P. fluorescens and/or P. fragi were highly abundant or even dominant in baby spinach. Significant variability in bacterial species composition among the different batches of each vegetable also was observed. At batch-level, the impact of temperature and/or storage time on bacterial microbiota was not apparent for baby spinach. Concerning rocket, the storage time was the most influencing factor for some batches resulting in reduction and increase of Pseudomonas species and lactic acid bacteria abundance, respectively. To conclude for both Chapters 2 and 3, a large-scale sampling of fresh-cut RTE produce should be conducted in order to assess the full biodiversity of its spoilage microbiota and unravel the impact of important environmental factors on microbial diversity and composition. In Chapter 4, the suitability of four analytical technologies (sensors) coupled with different machine learning algorithms for the evaluation of RTE pineapple’s quality was assessed, while the utilization potential of selected analytics tools, namely the Unscrambler software and the SorfML platform, also was explored. Pineapple samples stored at different temperature conditions were subjected to microbiological (total viable count, TVC) and sensory analyses, with parallel acquisition of Fourier transform infrared (FTIR), near infrared (NIR), fluorescence (FLUO), visible (VIS), and multispectral imaging (MSI) spectroscopy data. Similar trends concerning the applicability of the different sensors and algorithms were observed for both analytics tools. For TVC, almost all the combinations of sensors and the partial least squares regression (PLSR) algorithm showed relatively satisfactory performances. Moreover, most of the studied sensors in conjunction with linear support vector machine (SVM Linear) resulted in similar performances. Overall, the tested sensors apart from the NIR constitute promising tools for the assessment of pineapple’s microbiological spoilage. Concerning sensory features, FLUO spectral data and MSI sensor seem to be also promising for the evaluation of pineapple odour. Chapter 5 provided a comparative assessment of sensors and machine learning approaches for evaluating the microbiological spoilage of RTE rocket and baby spinach stored at different temperature conditions under modified atmosphere packaging (MAP). The samples were subjected to microbiological analysis (TVC and Pseudomonas spp.), and parallel acquisition of FTIR, NIR, VIS and MSI data. Two data partitioning approaches, namely random and dynamic data partitioning, and two machine learning algorithms, namely PLSR and radial support vector regression (SVR), were comparatively evaluated. Concerning baby spinach stored under passive MAP, the two algorithms yielded similar performances for most of the developed models. The random data partitioning resulted in better (for MSI and NIR) or similar (for FTIR and VIS) performances to the ones attained with the dynamic approach. Regarding rocket, the SVR algorithm resulted in better prediction for most of sensors, while random data partitioning yielded also considerably or slightly better results compared to the dynamic test set. The microbiological spoilage of baby spinach stored under passive MAP was better assessed by models derived mainly from the VIS sensor, while FTIR and MSI models were more suitable in rocket, with the selected best models exhibiting satisfactory performances. Contrarily, FTIR and MSI were more appropriate for TVC prediction of baby spinach stored under active MAP, exhibiting an even higher predictive power. The results indicated that personalised (i.e. product-specific) sensor applications and data analysis workflows are needed, while the applied storage conditions should be also taken into account. In Chapter 6, the assessment of microbiological spoilage of oyster mushrooms (Pleurotus ostreatus) using FTIR and MSI technologies was studied. Fresh-cut mushrooms were stored at different temperature conditions and were subjected to microbiological analysis (TVC) as well as to FTIR and MSI measurements. The FTIR and MSI data were collected for both the cap and the gills sides of mushrooms. Developed PLSR models for both mushroom sides exhibited poor prediction performances, regardless of the applied data partitioning, the reduction of the observed high spectral variability and the selection of the most informative independent variables. The results indicated that, under the conditions of this study and the applied computational analysis, the application of FTIR and MSI do not appear to be promising for the evaluation of the microbiological spoilage of oyster mushrooms.

Τα φρέσκα κομμένα προϊόντα ικανοποιούν την συνεχώς αυξανόμενη ανάγκη των καταναλωτών για υγιεινά και ταυτόχρονα γρήγορα και εύκολα στην προετοιμασία τρόφιμα. Βέβαια, οι φυσικά απαντώμενοι μικροβιακοί πληθυσμοί σε συνδυασμό με την επιπρόσθετη επιμόλυνση κατα την διάρκεια της επεξεργασίας τείνουν να περιορίζουν τον χρόνο ζωής αυτών των προϊόντων. Δεδομένης της περιορισμένης γνώσης για τις μικροβιακές κοινότητες που σχετίζονται με την αλλοίωση των φρέσκων κομμένων προϊόντων, ο ευρύτερος χαρακτηρισμός των κοινοτήτων αυτών και η μελέτη των σημαντικών περιβαλλοντικών παραγόντων που επηρεάζουν τη σύστασή τους κατά την διάρκεια της αποθήκευσης των εν λόγω προϊόντων, απαιτείται. Από την άλλη πλευρά, η εφαρμογή ταχέων και αποτελεσματικών μεθόδων για την ανίχνευση της μικροβιολογικής αλλοίωσής τους είναι επίσης σημαντική για την αντίστοιχη βιομηχανία. Οι δύο κύριοι στόχοι της παρούσας διατριβής ήταν: i) ο χαρακτηρισμός των μικροβιακών κοινοτήτων που σχετίζονται με την αλλοίωση διαφορετικών φρέσκων κομμένων προϊόντων κατά την αποθήκευσή τους σε διαφορετικές θερμοκρασίες, με τη χρήση μεταγενετικής προσέγγισης (Ενότητα Α: Κεφάλαια 2 και 3), και ii) η αξιολόγηση της μικροβιολογικής αλλοίωσης των παραπάνω προϊόντων μέσω της χρήσης γρήγορων αισθητήρων με βάση την φασματοσκοπία (Ενότητα Β : Κεφάλαια 4, 5 και 6). Όσον αφορά στο Κεφάλαιο 2, οι κοινότητες των ζυμών-μυκήτων και των βακτηρίων που σχετίζονται με την αλλοίωση του έτοιμου-προς-κατανάλωση (ready-to-eat, RTE) ανανά κατά την αποθήκευσή του σε διαφορετικές θερμοκρασίες ταυτοποιήθηκαν μέσω της μεταγενετικής αλληλούχισης των γενετικών περιοχών ITS2 και gyrB, αντίστοιχα. Παρατηρήθηκε υψηλή παραλλακτικότητα στη σύνθεση των ειδών ζυμών-μυκήτων μεταξύ των διαφόρων παρτίδων ανανά. Η αρχική μικροβιακή σύνθεση ήταν ο κύριος παράγοντας που καθόρισε την πρόοδο της αλλοίωσης. Δεδομένων των αρχικών επικρατέστερων ειδών, η επίδραση της θερμοκρασίας και του χρόνου αποθήκευσης ήταν ποικίλη. Σχετικά με τη μη κυρίαρχη βακτηριακή κοινότητα, η θερμοκρασία αλλά και η παρτίδα του προϊόντος δεν επηρέασαν σημαντικά την βακτηριακή ποικιλότητα και σύνθεση. Στο Κεφάλαιο 3, μια μεταγενετική προσέγγιση, βασισμένη στην αλληλούχιση του γενετικού δείκτη gyrB, εφαρμόστηκε επίσης για τον χαρακτηρισμό των βακτηριακών κοινοτήτων που σχετίζονται με την αλλοίωση RTE ρόκας και τρυφερών φύλλων σπανακιού, κατά την αποθήκευσή τους σε διαφορετικές συνθήκες θερμοκρασίας. Οι βακτηριακές κοινότητες των δυο λαχανικών διέφεραν στην κυριαρχία συγκεκριμένων βακτηριακών ειδών. Συγκεκριμένα, το Pseudomonas viridiflava ήταν κυρίαρχο στα περισσότερα δείγματα ρόκας, ενώ ένα νέο είδος Pseudomonas, καθώς και το P. fluorescens ή / και P. fragi ήταν ιδιαίτερα άφθονα ή ακόμα και κυρίαρχα στο σπανάκι. Παρατηρήθηκε επίσης σημαντική παραλλακτικότητα στη σύνθεση των βακτηριακών ειδών μεταξύ των διαφόρων παρτίδων κάθε είδους λαχανικού. Σε επίπεδο παρτίδας, η επίδραση της θερμοκρασίας ή /και του χρόνου αποθήκευσης στις βακτηριακές κοινότητες του σπανακιού δεν ήταν εμφανής. Σχετικά με την ρόκα, ο χρόνος αποθήκευσης ήταν ο πιο σημαντικός παράγοντας που είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση της αφθονίας κάποιων ειδών Pseudomonas και την παράλληλη αύξηση της αφθονίας γαλακτικών βακτηρίων. Συμπερασματικά για τα Κεφάλαια 2 και 3, η διεξαγωγή μεγάλης κλίμακας πειραμάτων σε φρέσκα κομμένα προϊόντα φυτικής προέλευσης είναι απαραίτητη για την πλήρη αξιολόγηση της βιοποικιλότητας των μικροβιακών κοινοτήτων που συμμετέχουν στη διαδικασία αλλοίωσης και για την ανάδειξη της επίδρασης σημαντικών περιβαλλοντικών παραγόντων στην μικροβιακή σύνθεση. Στο Κεφάλαιο 4, η καταλληλότητα τεσσάρων αισθητήρων σε συνδυασμό με διαφορετικούς αλγόριθμους μηχανικής μάθησης αξιολογήθηκε για την εκτίμηση της ποιότητας RTE ανανά, ενώ διερευνήθηκαν επίσης οι δυνατότητες επιλεγμένων αναλυτικών «εργαλείων», του λογισμικού The Unscrambler και της διαδικτυακής πλατφόρμας SorfML. Τα δείγματα ανανά αποθηκεύτηκαν σε διαφορετικές συνθήκες θερμοκρασίας και υποβλήθηκαν σε μικροβιολογική (ολική μεσόφιλη χλωρίδα, ΟΜΧ) και οργανοληπτική ανάλυση με παράλληλη συλλογή φασματικών δεδομένων φασματοσκοπίας υπέρυθρου με μετασχηματισμό Fourier (FTIR), εγγύς υπέρυθρου (NIR), φθορισμού (FLUO), ορατού (VIS), καθώς και πολυφασματικών εικόνων (MSI). Παρόμοιες τάσεις σχετικά με τη δυνατότητα εφαρμογής των διαφορετικών αισθητήρων και αλγορίθμων παρατηρήθηκαν για τα δυο λογισμικά. Για την ΟΜΧ, τα μοντέλα από σχεδόν όλους τους συνδυασμούς αισθητήρων με τον αλγόριθμο παλινδρόμησης μερικών ελαχίστων τετραγώνων (PLSR) παρουσίασαν σχετικά ικανοποιητικές επιδόσεις. Επιπλέον, η γραμμική μηχανή διανυσμάτων υποστήριξης (SVM Linear) σε συνδυασμό με την πλειοψηφία των αισθητήρων παρουσίασε παρόμοιες επιδόσεις. Συνολικά, όλοι οι αισθητήρες εκτός του NIR αποτελούν υποσχόμενα «εργαλεία» για την εκτίμηση της μικροβιολογικής αλλοίωσης φρέσκων κομμένων προϊόντων φυτικής προέλευσης. Σχετικά με τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, τα FLUO φασματικά δεδομένα και o MSI αισθητήρας φαίνεται να είναι επίσης κατάλληλοι για την αξιολόγηση της οσμής του ανανά. Το Κεφάλαιο 5 παρείχε μια συγκριτική αξιολόγηση διαφορετικών αισθητήρων και προσεγγίσεων μηχανικής μάθησης για την εκτίμηση της μικροβιολογικής αλλοίωσης RTE ρόκας και τρυφερών φύλλων (baby) σπανακιού κατά την αποθήκευσή τους σε διαφορετικές θερμοκρασίες και υπό συσκευασία τροποποιημένης ατμόσφαιρας (MAP). Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε μικροβιολογικές αναλύσεις (TVC και Pseudomonas spp.), με παράλληλη συλλογή φασματικών δεδομένων FTIR, NIR, VIS και MSI. Πραγματοποιήθηκε συγκριτική αξιολόγηση (i) δύο προσεγγίσεων κατανομής των δεδομένων σε σύνολα εκπαίδευσης και επαλήθευσης (τυχαία κατανομή και δυναμικά δεδομένα για επαλήθευση), και (ii) δύο αλγoρίθμων μηχανικής μάθησης [PLSR και παλινδρόμηση διανυσμάτων υποστήριξης (SVR) βασισμένησε πυρήνα ακτινικής βάσης (radial basis function, RBF)]. Όσον αφορά στο σπανάκι σε παθητικό MAP, οι δύο αλγόριθμοι παρουσίασαν παρόμοιες επιδόσεις για την πλειονότητα των ανεπτυγμένων μοντέλων. Η τυχαία κατανομή δεδομένων είχε ως αποτέλεσμα καλύτερες (για MSI και NIR) ή παρόμοιες (για FTIR και VIS) επιδόσεις συγκριτικά με τη χρήση των δυναμικών δεδομένων για επαλήθευση. Στην περίπτωση της ρόκας, ο αλγόριθμος SVR οδήγησε σε καλύτερη πρόβλεψη για σχεδόν όλους τους αισθητήρες, ενώ η τυχαία κατανομή δεδομένων έδωσε επίσης σημαντικά ή ελαφρώς καλύτερα αποτελέσματα. Η μικροβιολογική αλλοίωση του σπανακιού σε παθητικό MAP εκτιμήθηκε καλύτερα με μοντέλα που βασίστηκαν κυρίως σε φασματικά δεδομένα VIS, ενώ τα μοντέλα τα οποία αναπτύχθηκαν με βάση δεδομένα FTIR και MSI ήταν πιο κατάλληλα στην ρόκα, όλα με ικανοποιητικές επιδόσεις. Αντίθετα, οι αισθητήρες FTIR και MSI ήταν καταλληλότεροι για την πρόβλεψη της ΟΜΧ του σπανακιού σε ενεργό MAP, με υψηλότερη ικανότητα πρόβλεψης. Τα αποτελέσματα υπέδειξαν ότι απαιτείται εξατομικευμένη (για κάθε προϊόν) χρήση ασθητήρων και ανάλυση δεδομένων, ενώ οι συνθήκες αποθήκευσης των προϊόντων θα πρέπει επίσης, να λαμβάνονται υπόψη. Στο Κεφάλαιο 6, αξιολογήθηκε η εφαρμοσιμότητα των τεχνολογιών FTIR και MSI για την εκτίμηση της μικροβιολογικής αλλοίωσης των μανιταριών στρειδιών (Pleurotus ostreatus). Τα φρέσκα μανιτάρια αποθηκεύτηκαν σε διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες και υποβλήθηκαν σε μικροβιολογικές αναλύσεις (TVC), με παράλληλη συλλογή δεδομένων φασματοσκοπίας FTIR και MSI και για τις δυο πλευρές (του καπέλου και των ελασμάτων) των μανιταριών. Τα PLSR μοντέλα και για τις δύο πλευρές μανιταριών παρουσίασαν κακή επίδοση πρόβλεψης, ανεξάρτητα από τον εφαρμοζόμενο τρόπο διαχωρισμού των δεδομένων, την προσπάθεια μείωσης της παρατηρούμενης υψηλής φασματικής παραλλακτικότητας που παρατηρήθηκε και την επιλογή των πιο σημαντικών ανεξάρτητων μεταβλητών. Τα αποτελέσματα υπέδειξαν ότι, κάτω από τις συνθήκες της παρούσας μελέτης και της εφαρμοζόμενης υπολογιστικής ανάλυσης, η εφαρμογή των FTIR και MSI δεν είναι υποσχόμενη για την αξιολόγηση της μικροβιολογικής αλλοίωσης των συγκεκριμένων προϊόντων (μανιτάρια στρείδια).