Μελέτη μικροβιώματος, προσδιορισμός λιπαρών οξέων και ανάλυση αντιοξειδωτικού συστήματος γάλακτος από ελληνικές φυλές όνων

Abstract

Τα είδη γάλακτος που προέρχονται από μη παραδοσιακά ζώα (όνος, καμήλα, βουβάλι) κερδίζουν ολοένα και περισσότερο την προσοχή της επιστημονικής κοινότητας, κυρίως λόγω της καταλληλόλητάς τους να συμπληρώνουν τις ανάγκες ειδικών πληθυσμιακών ομάδων (βρέφη, ηλικιωμένοι). Τα τελευταία χρόνια, το γάλα όνου έχει αποκτήσει μεγάλη προσοχή λόγω της παρόμοιας φυσικοχημικής σύστασής του με εκείνης του ανθρώπινου γάλακτος καθώς και λόγω των ευεργετικών ιδιοτήτων του στην ανθρώπινη υγεία. Στην παρούσα μελέτη αναλύθηκαν εφτά δείγματα νωπού γάλακτος όνου, τα οποία συλλέχθηκαν από όλες τις γαλακτοπαραγωγές φάρμες όνων, διασκορπισμένες σε όλη την Ελλάδα. Αρχικά, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε κλασσική μικροβιολογική ανάλυση χρησιμοποιώντας επιλεκτικά θρεπτικά υποστρώματα και συνθήκες ανάπτυξης με σκοπό την καταμέτρηση των πληθυσμών επιλεγμένων μικροβιακών ομάδων. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε φυσικοχημική ανάλυση, ανάλυση αντιοξειδωτικού συστήματος και προσδιορισμός του προφίλ των λιπαρών οξέων. Στη συνέχεια απομονώθηκε το ολικό DNA από τα δείγματα για την ταυτοποίηση του μικροβιώματος (βακτήρια και ζύμες/μύκητες) μέσω της μεταγονιδιωματικής ανάλυσης αλληλούχης αμπλικονίων. Σύμφωνα με την καταμέτρηση των μικροβιακών ομάδων, αυξημένοι ήταν οι πληθυσμοί της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας και των ψυχρότροφων μικροοργανισμών στην πλειοψηφία των δειγμάτων αλλά και οι πιθανοί μεσόφιλοι κόκκοι, μεσόφιλοι γαλακτοβάκιλλοι και τα εντεροβακτήρια, σε διαφορετικά log CFU mL-1 στο κάθε δείγμα. Εξαίρεση αποτέλεσαν το δείγμα 7, στο οποίο δεν αναπτύχθηκαν καθόλου ψυχρότροφοι μικροοργανισμοί και τα δείγματα 5 και 6, στα οποία απουσίαζαν τα εντεροβακτήρια. Έπειτα από την ταυτοποίηση των μικροοργανισμών με τη χρήση μοριακών μεθόδων, το 54 % των απομονώσεων ταυτοποιήθηκαν ως οξυγαλακτικά βακτήρια (Lactic Acid Bacteria ; LAB) και συγκεκριμένα ανήκαν στα γένη Enterococcus, Lacticaseibacillus, Pediococcus, Lentilactobacillus και Leuconostoc. Μεγάλο ποσοστό συμμετοχής στην διαμόρφωση του μικροβιώματος του γάλακτος όνου καταλαμβάνουν ακόμα τα γένη Staphylococcus και Enterobacter. Όσον αφορά τις ζύμες, στα δείγματα ταυτοποιήθηκαν μόνο τρία είδη ζυμών, και συγκεκριμένα τα είδη Cutaneotrichosporon curvatum, Wickerhamiella pararugosa και Cutaneotrichosporon cutaneum. Σε αντίθεση με την κλασσική μικροβιολογική ανάλυση, από τα αποτελέσματα της μεταγονιδιωματικής ανάλυσης προκύπτει ότι το μικροβιακό προφίλ του συγκεκριμένου είδους γάλακτος είναι πλούσιο όχι μόνο σε βακτήρια αλλά και ζύμες/μύκητες. Μεταξύ των 100 ειδών ζυμών/μυκήτων, ανιχνεύθηκαν γένη που παρουσιάζουν ιδιαίτερο τεχνολογικό ενδιαφέρον, όπως τα γένη Kluyveromyces και Penicillium, αλλά και γένη με ανεπιθύμητες επιπτώσεις τόσο στην ανθρώπινη υγεία όσο και στις βιομηχανίες τροφίμων, όπως τα γένη Eurotium, Alternaria και Aspergillus. Τα βακτήρια που βρέθηκαν μέσω της μεταγονιδιωματικής ανάλυσης σχετίζονται με βακτήρια που απαντώνται στο γάλα αλλά και στο έδαφος, το νερό και τα φυτά. Ακόμα, η μεταγονιδιωματική ανάλυση επιβεβαιώνει την παρουσία των LAB, και συγκεκριμένα των γενών Lactobacillus, Enterococcus, Leuconostoc και Streptococcus. Μέσω της μεταγονιδιωματικής ανάλυσης δεν βρέθηκε το γένος Pediococcus, το οποίο ταυτοποιήθηκε μέσω της κλασσικής μικροβιολογικής ανάλυσης ενώ μέσω της ανάλυσης αυτής δεν ταυτοποιήθηκε το γένος Streptococcus. Η ανάλυση του προφίλ των λιπαρών οξέων ανέδειξε πως το παλμιτικό οξύ μαζί με τα λιπαρά οξέα (ΛΟ) μικρής και μεσαίας αλύσου (C8:0, C10:0, C12:0, C14:0) αποτελούν το μεγαλύτερο μέρος των κορεσμένων ΛΟ. Επιπλέον, βρέθηκε ότι το γάλα όνου είναι πλούσιο σε ακόρεστα ΛΟ, κυρίως σε μονοακόρεστα ΛΟ. Το βασικό ΛΟ των δειγμάτων αποτέλεσε το ελαϊκό οξύ, με εξαίρεση το δείγμα 3, στο οποίο το κυρίαρχο ΛΟ ήταν το παλμιτικό οξύ. Σχετικά με τα πολυακόρεστα ΛΟ, κύριοι εκπρόσωποι ήταν το λινελαϊκό οξύ και το α-λινολενικό οξύ. Τέλος, σύμφωνα με την ανάλυση του αντιοξειδωτικού συστήματος τα δείγματα παρουσίασαν διαφορές ως προς το αντιοξειδωτικό τους περιεχόμενο, δεδομένου ότι αυτό επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες, όπως η διατροφή των όνων. Η παρούσα μελέτη αποτελεί την πρώτη αποτύπωση του μικροβιώματος (βακτήρια και ζύμες/μύκητες) δειγμάτων νωπού γάλακτος όνου από όλες τις γαλακτοπαραγωγές φάρμες όνων στην Ελλάδα, χρησιμοποιώντας μία ολιστική προσέγγιση που συνδυάζει την κλασσική μικροβιολογική και την μεταγονιδιωματική ανάλυση αλληλούχησης αμπλικονίων. Εκτός αυτού, μία ακόμα πρωτοτυπία αυτής της μελέτης αποτελεί η πραγματοποίηση αναλύσεων που σχετίζονται με την ποιότητα του γάλακτος όνου, και συγκεκριμένα η ανάλυση του προφίλ των ΛΟ αλλά και του αντιοξειδωτικού συστήματος, καλύπτοντας όλες τις γαλακτοπαραγωγές φάρμες της Ελλάδος.

Milks from non-traditional animal species (donkey, camel, buffalo) are increasingly gaining the attention of the scientific community, mainly due to the fact that they are considered suitable to supplement the needs of special population groups (infants, the elderly). In recent years the attention on donkey milk has increased because of its similar physicochemical composition to human milk and its beneficial effects on human health. In the present study, seven raw donkey milk samples collected from all the dairy farms throughtout Greece. Samples were initially subjected to the classical microbiological analysis using selective growth media and culture conditions in order to count selected microbial groups. In the meantime, the samples undergo physicochemical analysis, assessment of the antioxidant system and determination of fatty acid profile. Afterwards, total DNA was extracted from all samples to identify the microbiome (bacteria and yeast/fungi) through amplicon-based metagenomics analysis. The colony count method of raw donkey milk samples revealed increased populations of total mesophilic flora and psychrotrophic microorganisms in the majority of the samples. Also high presumptive mesophilic cocci, mesophilic lactobacilli and Enterobacteriaceae populations were counted, in different counts in each sample. An exception in this study was the sample 7, in which no psychrotrophic microorganisms were grown. Enterobacteriaceae populations were also absent in samples 5 and 6. Based on molecular techniques, 54% of the isolates were identified as Lactic Acid Bacteria (LAB), in particular belonging to the genera Enterococcus, Lacticaseibacillus, Pediococcus, Lentilactobacillus and Leuconostoc. The genera Staphylococcus and Enterobacter still occupy a large percentage of milk microbiome. Regarding yeasts, Cutaneotrichosporon curvatum, Wickerhamiella pararugosa and Cutaneotrichosporon cutaneum, were the only three species identified. In contrast to classical microbiological analysis, the results of metagenomic analysis showed the rich microbial profile of donkey milk of bacteria and yeasts/fungi. Among the 100 species of yeasts/fungi which were detected, there were genera with technological interest, such as the genera Kluyveromyces and Penicillium, and genera with adverse effects on both human health and food industry, such as the genera Eurotium, Alternaria and Aspergillus. Concerning bacteria found, they are associated with bacteria found in milk as well as in soil, water and plants. Furthermore, metagenomics analysis confirms the presence of LAB, specifically the genera Lactobacillus, Enterococcus, Leuconostoc and Streptococcus. The genus Pediococcus which was identified through the classical microbiological analysis, was not found through the metagenomics analysis, while the genus Streptococcus was not identified through the classical microbiological analysis. The analysis of the fatty acid profile revealed that the palmitic acid, the short and medium chained fatty acids (FA) (C8:0, C10:0, C12:0, C14:0) constitute the largest part of saturated fatty acids. Furthermore, the donkey milk samples were characterized by a high unsaturated fatty acids content, mainly monounsaturated fatty acids. The basic FA of the samples was oleic acid, apart from sample 3, in which the predominant fatty acid was palmitic acid. Regarding polyunsaturated fatty acids, the most abundant fatty acids were linoleic acid and α-linolenic acid. Finally, according to the assessment of the antioxidant system, differences were observed in the samples for the antioxidant content, as this is influenced by many factors such as the effect of different feeding strategies. This is the first report on the microbiome (bacteria and yeasts/fungi) of raw donkey milk from all Greek dairy farms by a holistic approach combining both classical microbiological and amplicon-based metagenomics analyses. In addition, another innovation of the research was the implementation of analyses which are related to the quality of milk, specifically the determination of the fatty acid profile and the antioxidant system, covering all the dairy farms of Greece.