Μελέτη της επαγωγής της κατάστασης ζώντα αλλά μη καλλιεργήσιμα και μοριακός χαρακτηρισμός αυτής σε μεμονωμένα κύτταρα Listeria monocytogenes με τη χρήση απολυμαντικών

Abstract

Τα βακτήρια, προκειμένου να επιβιώνουν σε αντίξοα περιβάλλοντα, ενεργοποιούν βιολογικούς μηχανισμούς απόκρισης στην καταπόνηση, που τα καθιστούν πιο ανθεκτικά σε αυτήν. Ένας τύπος απόκρισης αποτελεί η μετάπτωση ορισμένων μη σποριογόνων βακτηρίων σε μία κατάσταση μειωμένης μεταβολικής ενεργότητας, που ονομάζεται κατάσταση «ζώντα αλλά μη καλλιεργήσιμα». Ένα από αυτά τα βακτήρια είναι το τροφιμογενές παθογόνο Listeria monocytogenes, το οποίο εντοπίζεται ευρέως στο περιβάλλον της βιομηχανίας των τροφίμων και συνδέεται κυρίως με έτοιμα προς κατανάλωση τρόφιμα που συντηρούνται υπό ψύξη. Αν και τα κρούσματα λιστερίωσης δεν υπερβαίνουν τα 0,1-10 ανά 1.000.000 άτομα ανά έτος παγκοσμίως, το υψηλό ποσοστό θνητότητας της ασθένειας (20-30%) καθιστά τη L. monocytogenes επικίνδυνη για τη δημόσια υγεία. Στόχος της παρούσας έρευνας ήταν η διερεύνηση της απόκρισης του βακτηριακού πληθυσμού της L. monocytogenes στην καταπόνηση που προκαλείται από τα απολυμαντικά υποχλωριώδες νάτριο (SH) και υπεροξικό οξύ (PAA) και ιδιαίτερα της επαγωγής τους στην κατάσταση «ζώντα αλλά μη καλλιεργήσιμα» ή viable but non culturable (VBNC). Συγκεκριμένα, σε πρώτο στάδιο μελετήθηκε η επίδραση του SH και του PAA στον καλλιεργήσιμο πληθυσμό μεγέθους 107 CFU/mL του στελέχους Scott A της L. monocytogenes, καθώς αυτός υποβλήθηκε σε συνδυασμό καταπόνησης λιμού και οξειδωτικής καταπόνησης. Οι παράγοντες οξειδωτικής καταπόνησης ήταν τα διαλύματα SH 0,5, 5, 10, ppm και PAA 0,5, 5, 10, 20, 30 και 40 ppm, ενώ ο λιμός προκλήθηκε εξαιτίας της απουσίας θρεπτικών στοιχείων από το μέσο διάλυσης των απολυμαντικών. Τα βακτήρια παρέμεινα σε κάθε ένα από τα διαλύματα καταπόνησης στους 20 και στους 4 ℃ για μισή ώρα. Ο προσδιορισμός της κινητικής θανάτωσης των βακτηρίων έγινε μέσω της καλλιέργειας των καταπονημένων σε γενικό θρεπτικό υπόστρωμα TSA-Ye, οπότε προσδιορίστηκε το μέγεθος του ολικού πληθυσμού, από την καταμέτρηση των αποικιών. Παρομοίως, προσδιορίστηκε ο αριθμός των τραυματισμένων βακτηρίων. Για το σκοπό αυτό τα βακτήρια καλλιεργήθηκαν και σε υπόστρωμα TSA-Ye που περιείχε 5% NaCl. Ο πληθυσμός των τραυματισμένων κυττάρων υπολογίστηκε μέσω και της αφαίρεσης του αριθμού των ανθεκτικών στην οξειδωτική καταπόνηση κυττάρων που σχημάτισαν αποικίες στο επιλεκτικό υπόστρωμα, από το σύνολο των βακτηρίων. Σε δεύτερο στάδιο, εξετάστηκε η επαγωγή 109 CFU/mL L. monocytogenes στην κατάσταση «ζώντα αλλά μη καλλιεργήσιμα», έπειτα από την επώασή των κυττάρων σε διαλύματα 20, 30 και 40 ppm PAA. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε TSA-Ye και, παράλληλα, παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού, έπειτα από χρώση τους με τα φθοροφόρα cFDA και PI. Ακολούθησε η μελέτη της ανάκαμψής τους από την κατάσταση τραυματισμού και VBNC. Αφού λοιπόν τα βακτήρια απομακρύνθηκαν από το διάλυμα του PAA, συγκέντρωσης 20, 30 ή 40 ppm, επιστρώθηκαν σε TSA-Ye και επωάστηκαν στους 37 ℃. Κατά τη διάρκεια της επώασής των κυττάρων, γινόταν παρατήρηση της ανάπτυξής τους με τη χρήση βιντεομικροσκοπίας. Τέλος, μελετήθηκε η έκφραση των γονιδίων clpP, sigB, prfA, lmo0887, inlA, lmo0888 και relA κατά τη διάρκεια της καταπόνησης και της επαγωγής των βακτηρίων στην κατάσταση VBNC, μέσω RT-qPCR την 0η, 1η, 2η, και 3η ώρα επαφής τους με 40 ppm PAA. Η επώαση των κυττάρων υπό την παρουσία 5 ppm SH κατέληξε στην απουσία ανάπτυξης αποικιών στα τρυβλία που περιείχαν είτε το γενικό, είτε το επιλεκτικό θρεπτικό υπόστρωμα έπειτα από το πρώτο λεπτό της καταπόνησης, ενώ όταν χρησιμοποιήθηκαν 10 ppm SH, δεν παρατηρήθηκαν αποικίες από την έναρξη της καταπόνησης και στις δύο θερμοκρασίες. Αναφορικά με το PAA, ο βακτηριακός πληθυσμός έπαψε να είναι καλλιεργήσιμος από τα 600 s επώασης σε 10 ppm απολυμαντικού στους 20 ℃ και από τα 900 s στα 20 ppm στους 4 ℃. Από τη σύγκριση των τρυβλίων και των εικόνων του μικροσκοπίου, διαπιστώθηκε η ύπαρξη VBNC κυττάρων την 3η ώρα της επώασης σε 40 ppm PAA, στους 20 ℃, ενώ δεν παρατηρήθηκε ανάκαμψή τους. Τα αποτελέσματα της RT-qPCR κατέδειξαν αρνητική ρύθμιση της έκφρασης του συνόλου των γονιδίων, εκτός του clpP, το οποίο φάνηκε να υπερεκφράζεται κατά τη 0η και τη 2η ώρα της βακτηριακής επώασης σε 40 ppm PAA, στους 20 ℃. Τα ευρήματα της έρευνας θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για την ορθότερη χρήση των απολυμαντικών στις βιομηχανίες τροφίμων, καθώς και να αποτελέσουν τη βάση για την περεταίρω μελέτη και την αποτελεσματική ανίχνευση των ζώντων αλλά μη καλλιεργήσιμων κυττάρων στα τρόφιμα και στα περιβάλλοντα των τροφίμων.

Bacteria, to survive in adverse environments, activate several kinds of stress response. One type of response is the transformation of certain non-sporogenic bacteria into a state of diminished vitality, called the "Live But Not Culturable" state. One of these bacteria is the foodborne pathogen Listeria monocytogenes, which is widely found in the food industry environments and is mainly associated with ready-to-eat refrigerated foods. Although listeriosis cases do not exceed 0.1-10 per 1,000,000 people per year worldwide, the high rate of disease mortality (20-30%) makes L. monocytogenes dangerous to public health. The aim of the present study was to investigate the response of the bacterial population of L. monocytogenes to the stress caused by disinfectant sodium hypochlorite (SH) and peracetic acid (PAA) and, their induction in the "Live But Not Culturable" or VBNC state. Specifically, the effect of SH and PAA on 107 CFU/mL of culturable L. monocytogenes strain Scott A subpopulation was studied, as the cells were subjected to a combination of famine and oxidative stress. As oxidizing agents, the solutions SH 0.5, 5, 10, ppm and PAA 0.5, 5, 10, 20, 30 and 40 ppm were selected, while the famine was caused due to the absence of nutrients in the medium. The bacteria remained submerged in the solutions at 20 and 4 ℃ for half an hour. The determination of the bacterial killing kinetics was done through their culture in general growth medium TSA-Ye. The size of the total culturable population was determined by colony counts. Similarly, the number of injured bacteria was determined. For this purpose, the bacteria were also cultured on a TSA-Ye substrate containing 5% NaCl. The population of injured cells was calculated by subtracting the number of oxidative-resistant cells that formed colonies on the selective substrate from total bacteria. In a second step, the induction of 109 CFU/mL L. monocytogenes into the "viable but non culturable" state was examined, after incubating the cells in 20, 30 and 40 ppm PAA solutions. The cells were plated on TSA-Ye and, at the same time, observed by fluorescence microscopy, after staining with the fluorophores cFDA and PI. This was followed by the study of their resuscitation. After the bacteria were removed from the PAA solution at a concentration of 20, 30 or 40 ppm, they were plated on TSA-Ye and incubated at 37 ℃. During the incubation of the cells, their growth was observed using video microscopy. Finally, the expression of the clpP, sigB, prfA, lmo0887, inlA, lmo0888 and relA genes was studied during the stress implementation and induction of bacteria in the VBNC state, via RT-qPCR at the 0, 1st, 2nd, and 3rd hour of contact with the stress solution of 40 ppm PAA. Incubation of cells in the presence of 5 ppm SH resulted in the absence of colony growth in plates containing either the general or selective growth medium after the first minute of strain, whereas when 10 ppm SH were used, no colonies were observed from the first moment of incubation, at both temperatures. Regarding PAA, the bacterial population ceased to be culturable since the 600th s of incubation in the 10 ppm solution of the disinfectant at 20 ℃ and since the 900th s at 20 ppm at 4 ℃. Comparison of the plates and microscope images revealed the presence of VBNC cells at the 3rd hour of incubation at 40 ppm PAA at 20 ℃, while no recovery was observed. The RT-qPCR results showed downregulation of expression of all genes, except of clpP’s, which appeared to be upregulated. The research findings could be used for better use of disinfectants in the food industry, as well as to be the basis for further study and effective detection of live but non-culturable cells in foods and food environments.