Διερεύνηση της οικοφυσιολογίας του σπόρου και του μικροπολλαπλασιασμού του Dianthus cruentus

Abstract

Ο Dianthus cruentus Griseb. (οικ. Caryophyllaceae) αποτελεί ένα ποώδες πολυετές είδος, αυτοφυές της Ελληνικής χλωρίδας και εξαπλωνόμενο στη Βαλκανική χερσόνησο και τη δυτική Ασία. Πρόκειται για είδος με έντονο καλλωπιστικό ενδιαφέρον λόγω των αρχιτεκτονικών ταξιανθιών του και του συμπαγούς γλαυκοπράσινου φυλλώματός του, ιδιαίτερα ανθεκτικό σε ξηρά και φτωχά εδάφη, το οποίο προσελκύει επικονιαστές, όπως πεταλούδες και μέλισσες. Επιπρόσθετα, παρουσιάζει ενδιαφέρον και για τη φαρμακευτική χρήση του λόγω της ισχυρής αντιοξειδωτικής δράσης του. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε αρχικά ο προσδιορισμός των κατάλληλων συνθηκών για τη μεγιστοποίηση της βλαστικότητας των σπόρων του τόσο σε in vitro όσο και σε in vivo συνθήκες. Χρησιμοποιήθηκαν δύο σπορομερίδες συλλεχθείσες από αυτοφυή πληθυσμό του είδος στο όρος Καλλίδρομο Φθιώτιδας, ηλικίας 0 και 12 μηνών, χωρίς κάποια προμεταχείριση. Για τη βλάστηση in vitro οι σπόροι απολυμάνθηκαν επιφανειακά με διάλυμα χλωρίνης 20% για 10 λεπτά και αφού ξεπλύθηκαν με απεσταγμένο νερό τοποθετήθηκαν σε τρυβλία Petri με θρεπτικό υπόστρωμα ½ MS, σε συνθήκες φωτοπεριόδου 16 h, με ένταση φωτός 37,5 μmol m-2 s-1 προερχόμενη από λαμπτήρες φθορισμού, σε θερμοκρασίες 5, 10, 15, 20 ή 25 °C. Η θερμοκρασία των 15 °C έδωσε τα υψηλότερα ποσοστά βλαστικότητας τόσο στους σπόρους πρόσφατης συλλογής (98%) όσο και στους σπόρους ηλικίας 12 μηνών (100%). Τα χαμηλότερα ποσοστά βλαστικότητας σημειώθηκαν στις δύο ακραίες θερμοκρασίες των 5 °C και 25 °C (18% και 15% αντίστοιχα), με ιδιαίτερα χαμηλές τιμές για τους σπόρους πρόσφατης συλλογής. Σε όλες τις θερμοκρασίες πλην των 5 °C οι σπόροι βλάστησαν ταχύτατα (Τ50 = 2-6 d). Η ηλικία των σπόρων επηρέασε σημαντικά τη βλάστησή τους, αυξάνοντας σημαντικά το ποσοστό βλαστικότητας στις δύο ακραίες θερμοκρασίες, καταδεικνύοντας τη θετική επίδραση της ξηρής μεθωρίμανσης των σπόρων. Για τη βλάστηση ex vitro, οι σπόροι τοποθετήθηκαν σε φυτοδοχεία με εδαφικό υπόστρωμα τύρφης-περλίτη (1:1, v/v) σε θάλαμο σταθερών συνθήκων με θερμοκρασία 15, 20 ή 25 °C. Η υψηλότερη βλαστικότητα σημειώθηκε στους 15° C και για τις δύο ηλικίες σπόρων (97-99%), ενώ η χαμηλότερη στους 25 °C (62% και 4% για τους σπόρους 12 και 0 μηνών, αντίστοιχα). Τα ποσοστά βλαστικότητας ήταν ελαφρώς χαμηλότερα σε σχέση με τη βλάστηση in vitro, ιδίως στους 25 °C. Διερευνήθηκε επίσης ο μικροπολλαπλασιασμός του είδους, με την εγκατάσταση εκφύτων από σπορόφυτα κόμβου και κορυφής και τη διενέργεια τεσσάρων υποκαλλιεργειών σε στερεά υποστρώματα. Σε όλα σχεδόν τα στάδια του πολλαπλασιασμού έγινε χρήση υποστρωμάτων που περιείχαν θρεπτικό μέσο MS και 8 g L-1 άγαρ, καθώς και τις κυτοκινίνες BA, 2iP και ΖΕΑ, χωρίς ή με τη παρουσία της αυξίνης ΝΑΑ, με τη χρήση εκφύτων από φυσιολογικούς ή υπερενυδατωμένους βλαστούς. Στα υποστρώματα εγκατάστασης με 0,1 mg L-1 BA ή 0,1 ή 0,5 mg L-1 2iP καταγράφηκαν υψηλά ποσοστά αντίδρασης (72-87%), όμως πολλοί από τους βλαστούς ήταν υπερενυδατωμένοι, με παραμορφωμένη, υαλώδη εμφάνιση. Ο αριθμός των υπερενυδατωμένων βλαστών και ο αριθμός των κόμβων φάνηκε να είναι μεγαλύτερος στα υποστρώματα με 2iP, με το μεγαλύτερο αριθμό φυσιολογικών βλαστών (2,3) να εκπτύσσονται στο υπόστρωμα με 0,1 mg L-1 BA. Στο στάδιο της 1ης υποκαλλιέργειας, παρατηρήθηκε αυξημένη παρουσία υπερενυδατωμένων βλαστών στο υπόστρωμα που περιείχε 2iP, ενώ καταγράφηκε αυξημένο ποσοστό βλαστογένεσης και υπερενυδατωμένων βλαστών σε υπερενυδατωμένα έκφυτα που καλλιεργήθηκαν σε υπόστρωμα MS χωρίς φυτορμόνες. Στο στάδιο της 2ης υποκαλλιέργειας, η παρουσία 0,1 mg L-1 BA έδωσε το μεγαλύτερο αριθμό βλαστών ανεξαρτήτως της φυσιολογίας των εκφύτων, ενώ η προσθήκη 0,05 mg L-1 ΝΑΑ οδήγησε σε σημαντική αύξηση των φυσιολογικών βλαστών και μείωση της υπερενυδάτωσης όταν έγινε χρήση υπερενυδατωμένων εκφύτων. Στην 3η υποκαλλιέργεια, στα έκφυτα προερχόμενα από φυσιολογικούς βλαστούς το μεγαλύτερο δυναμικό πολλαπλασιασμού (4,5) και ο μέγιστος αριθμός φυσιολογικών βλαστών (3,6) καταγράφηκε σε υπόστρωμα MS με 2 mg L-1 ΒΑ, ενώ στα έκφυτα υπερενυδατωμένης φυσιολογίας η αύξηση της συγκέντρωσης του άγαρ σε 12 g L-1 έδωσε το μεγαλύτερο αριθμό φυσιολογικών βλαστών (2,4). Τα υψηλότερα ποσοστά υπερενυδάτωσης και στις δύο περιπτώσεις καταγράφηκαν σε υπόστρωμα MS με 0,1 mg L-1 ZEA. Αντίθετα, στη 4η υποκαλλιέργεια, η χρήση του υποστρώματος αυτού έδωσε το μεγαλύτερο δυναμικό πολλαπλασιασμού στο στάδιο αυτό (4,8). Συνολικά, η χρήση υποστρώματος MS με 0,1 BA και 0,05 mg L-1 NAA έδωσε το μεγαλύτερο δυναμικό πολλαπλασιασμού (5,1) ανεξαρτήτως της φυσιολογίας εκφύτου, με τη μέγιστη τιμή του (5,2) να καταγράφεται κατά την καλλιέργεια υπερενυδατωμένων εκφύτων σε υπόστρωμα MS με 12 g L-1 άγαρ. Η παρουσία φυτορμονών αύξησε την καλογένεση στη βάση των εκφύτων, ενώ οι υψηλές συγκεντρώσεις κυτοκινινών μείωσαν τη ριζογένεση. Η ριζοβολία του D. cruentus πραγματοποιήθηκε σε υποστρώματα MS ή ½ MS παρουσία ή απουσία IBA. Η χρήση υποστρώματος MS έδωσε χαμηλότερα ποσοστά ριζοβολίας (55-70%) για τις χαμηλότερες συγκεντρώσεις IBA (0 ή 0,1 mg L-1). Η βέλτιστη συγκέντρωση του IBA ήταν 0,5 mg L-1 ανεξαρτήτως του υποστρώματος προέλευσης των μικροβλαστών και του θρεπτικού μέσου, με ποσοστά ριζοβολίας 83-100%, ενώ σε ορισμένες περιπτώσεις παρουσιάστηκε επίδραση του περιεχομένου σε κυτοκινίνες των υποστρωμάτων πολλαπλασιασμού στον αριθμό και το μέσο μήκος των ριζών. Ο ex vitro εγκλιματισμός των έρριζων μικροβλαστών ολοκληρώθηκε με ποσοστό επιτυχίας 91% σε υπόστρωμα τύρφης: περλίτη (1:1, v/v). Παρατηρήθηκαν σημαντικές μορφολογικές διαφορές μεταξύ των εγκλιματισμένων φυταρίων όπως διαφορές στο μήκος και τον αριθμό βλαστών και κόμβων, οι οποίες οφείλονταν στα διαφορετικά υποστρώματα πολλαπλασιασμού, ενώ η παρουσία IBA στο υπόστρωμα ριζοβολίας φάνηκε να έχει ευνοϊκή επίδραση στην επιβίωσή τους. Τέλος, η χρήση ενιαίου σταδίου πολλαπλασιασμού-ριζοβολίας διάρκειας 60 ημερών σε υπoστρώματα MS χωρίς φυτορμόνες ή με BA ή 2iP και NAA έδωσε φυτάρια με το μεγαλύτερο αριθμό βλαστών και κόμβων και υψηλό ποσοστό ριζοβολίας (88%), τα οποία εγκλιματίστηκαν επιτυχώς σε ποσοστό 86%.

Dianthus cruentus Griseb. (Caryophyllaceae) is a herbaceous perennial species native to the Balkan Peninsula, including Greece, and western Asia. It is a species of great ornamental interest due to its architectural inflorescences and its compact blue-green foliage, particularly resistant to dry and poor soils and attractive to pollinators such as butterflies and bees. In addition, it is a species of medical potential due to its strong antioxidant action. In the present study, the determination of the appropriate conditions for maximizing the germination of its seeds in both in vitro and in vivo conditions was initially investigated. Two seed lots collected from a native population of the species on Mount Kallidromo, Fthiotida, dry-stored for 0 or 12 months, were used, without any pre-treatment. Regarding in vitro germination, the seeds were surface sterilized with a 20% commercial bleach water solution for 10 minutes, were then rinsed with distilled water and afterwards were placed in Petri dishes containing ½ MS medium, under 16 h photoperiod from 37.5 μmol m-2 s-1 fluorescent light, at temperatures of 5, 10, 15, 20 or 25 °C. The optimum temperature for seed germination was 15 °C, in which the highest germination ability in both recently collected (98%) and 12-month-old seeds (100 %) was observed. The lowest germination percentages were recorded at the two extreme temperatures of 5 °C and 25 °C, with particularly low values for recently collected seeds (18% and 15%). At all temperatures, minus that of 5 °C, the seeds germinated rapidly (T50 = 2-6 d). The duration of the seeds’ dry storage significantly affected their germination, increasing the germination percentage at the 2 extreme temperatures and demonstrating the positive effect of dry afterripening. As for ex vitro germination, the seeds were placed in pots with a mixture of peat-perlite (1: 1, v/v) and were incubated in growing chambers at temperatures of 15, 20 or 25 °C. The highest germination percentage was observed at 15 °C for both seed lots (97-99%), while the lowest at the temperature of 25 °C (62% and 4% for the 0- and 12-months-old seeds respectively). Germination ability was slightly lower in ex vitro germination, especially at 25 °C. Furthermore, the micropropagation of the species from explants excised from 2-month-old seedlings was investigated on solid substrates. Substrates containing MS medium and 8 g L-1 agar were used in almost all substages of the proliferation stage, and the effects of cytokinins BA, 2iP and ZEA, with the absence or the presence of auxin NAA, were investigated, using explants derived from non-hyperhydric or hyperhydric shoots. In the initial culture substrates containing 0.1 mg L-1 BA or 0.1 or 0.5 mg L-1 2iP the explants produced shoots at a high percentage (72-87%), but many of these were shown to be hyperhydric, with abnormal morphology and vitreous appearance. The number of hyperhydric shoots and the number of nodes seemed to be higher on substrates containing 2iP, with the largest number of normal shoots (2.3) appearing in the substrate containing 0.1 mg L-1 BA. During the 1st subculture stage, hyperhydric shoots were observed in bigger numbers in the substrate containing 2iP, while an increase in shoot proliferation and the number of hyperhydric shoots was correlated with the use of hyperhydric explants grown on hormone-free MS substrate. In the 2nd subculture stage, the presence of 0.1 mg L-1 BA yielded the largest number of shoots regardless of the physiology of the explants, while the addition of 0.05 mg L-1 resulted in a significant increase in the number of normal shoots and a reduction in hyperhydricity rates when hyperhydric explants were used. In the 3rd subculture, when explants derived from non-hyperhydric shoots were used the highest value of the multiplication index (4.5) and the maximum number of shoots (3.6) was recorded in MS substrate containing 2 mg L-1 BA. Increasing the concentration of agar to 12 g L-1 produced the largest number of shoots (2.4) when hyperhydric explants were used. In both cases, the highest percentages of hyperhydricity were recorded on MS substrate containing 0.1 mg L-1 ZEA. In contrast, during the 4th subculture, the use of this substrate resulted in the greatest multiplication index value at this stage (4.8). Overall, the use of MS substrate with 0.1 mg L-1 BA and 0.05 mg L-1 NAA resulted in the highest values of the proliferation index (5.1) regardless of the physiology of the explants used, with its maximum value (5.2) recorded from the culture of hyperhydric explants on MS substrate containing 0.1 mg L-1 BA and 12 g L-1 agar. The presence of phytohormones in the substrates increased the production of callus around the base of the explants, while high concentrations of cytokinins lessened the occurence of roots. D. cruentus microshoots were rooted in MS or ½ MS substrates in the presence or absence of IBA. The use of MS substrate resulted in lower rooting rates (55-70%) when lower concentrations of IBA were used (0 or 0.1 mg L-1). The optimal concentration of IBA was found to be 0.5 mg L-1 regardless of the multiplication substrate where the microshoots originated or the nutrient medium used in the rooting substrate, with rooting rates of 83-100%, while in some instances a carry-over effect, caused by the cytokinin content of the shoot proliferation substrates, was observed on the roots’ number and median length. The ex vitro acclimatization of the rooted microshoots was completed with a success rate of 91% using a peat:perlite substrate (1:1, v/v). Significant morphological differences were observed between acclimatized plantlets, including differences in stem length and total number of shoots and nodes, which were correlated with the influence of different shoot proliferation and/or rooting substrates, while the presence of IBA during rooting seemed to have an amendable effect on their survival. Finally, the use of an integrated, 60-days-long propagation protocol with shoot proliferation and rooting occurring concurrently in one stage on MS substrates free of PGRs or containing BA or 2iP and NAA produced rooted young plants at a high percentage (88%), which had the maximum observed total number of shoots and nodes and were then successfully acclimatized, surviving at a percentage of 86%.