Μελέτη μεταβολισμού ζυμομύκητα σε δύο επίπεδα θρέψης οργανικού αζώτου

Abstract

Τα τελευταία χρόνια υπάρχει ολοένα μεγαλύτερο ενδιαφέρον για την κατανόηση του ρόλου του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του οίνου, και ειδικά στο άρωμα του, με έμφαση κυρίως στην παρακολούθηση των ενζυματικών και μεταβολικών μηχανισμών που είναι υπεύθυνοι για τη συμβολή αυτή. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής μελέτης είναι η παρακολούθηση του μεταβολισμού του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae σε δύο επίπεδα θρέψης οργανικού αζώτου και ο προσδιορισμός της σχέσης συγκεκριμένων μεταβολικών διεργασιών του ζυμομύκητα με την παραγωγή πτητικών συστατικών του αρώματος των οίνων. Ειδικότερα, γλεύκος ποικιλίας Μοσχοφίλερο εμβολιάστηκε με εμπορικό στέλεχος ζυμομύκητα και πραγματοποιήθηκαν μικροοινοποίησεις με πρωτόκολλο οινοποίησης που διαφέρει ως προς τη θρέψη οργανικού αζώτου, ώστε να προκύψουν δύο επίπεδα θρέψης, ένα χαμηλό και ένα υψηλό. Κατά τη διάρκεια της αλκοολικής ζύμωσης μετρούταν η κατανάλωση σακχάρων, το αφομοιώσιμο άζωτο (ΥAN) και η βιομάζα του ζυμομύκητα. Σε τέσσερα σημεία της αλκοολικής ζύμωσης και συγκεκριμένα στον εμβολιασμό, 48 ώρες μετά την έναρξη της αλκοολικής ζύμωσης, στα 2/3 της αλκοολικής ζύμωσης και στο τέλος της αλκοολικής ζύμωσης, πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες γλεύκους και βιομάζας. Στα δείγματα γλεύκους προσδιορίστηκε το προφίλ των πτητικών ενώσεων με αέρια χρωματογραφία-φασματοφωτομετρία μάζας (SPE-GC-MS). Στη βιομάζα που απομονώθηκε πραγματοποιήθηκε εκχύλιση RNA με σκοπό να προσδιοριστεί με RT-PCR η έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τη απελευθέρωση τερπενίων και παραγωγή εστέρων, όπως ATF1, ATF2, EEB1, EHT1, IAH1, BGL2, EXG1. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, οι οξικοί εστέρες, η λιναλοόλη και η νερόλη παρουσίασαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών επιπέδων θρέψης, γεγονός που επιβεβαιώνει την εξειδίκευση στην παραγωγή πτητικών ενώσεων μεταξύ διαφορετικών επιπέδων συγκέντρωσης αζώτου. Τα αποτελέσματα της PCR πραγματικού χρόνου έδειξαν ότι, τα γονίδια που εμπλέκονται στην παραγωγή αιθυλικών και οξικών εστέρων είχαν, γενικά, υψηλότερα επίπεδα έκφρασης στην υψηλή προσθήκη αζώτου (300 mg/L YAN). Επιπλέον, παρατηρήθηκε αύξηση της σχετικής έκφρασης των γονιδίων BGL2 και EXG1, στην περίπτωση υψηλής περιεκτικότητας σε άζωτο που συσχετίζεται με τη συγκέντρωση τερπενολών. Η παρούσα μελέτη έδειξε την επίδραση της αζωτούχας θρέψης στο πτητικό προφίλ των οίνων και στη σχετική έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων που εμπλέκονται στη παραγωγή των πτητικών ενώσεων. Η μεταβολική ανάλυση επιλεγμένων πτητικών συστατικών του αρώματος σε συνδυασμό με μεταγραφικές αναλύσεις παρέχουν μια εξαιρετική προσέγγιση για τον προσανατολισμό της διαδικασίας ζύμωσης προς ένα επιθυμητό αρωματικό προφίλ.

Great interest has been developing in recent years in the impact of the yeast Saccharomyces cerevisiae on the aroma profile of wine, and the understanding of the enzymatic and metabolic mechanisms responsible for this contribution. The objective of this work is to study the metabolism of Saccharomyces cerevisiae at two levels of organic nitrogen supplementation and to investigate specific metabolic processes of the yeast that are directly related to the biosynthesis and the production of the volatile compounds of wine. A commercial yeast strains was inoculated in Moschofilero grape must under two different concentrations of nitrogen, a low at 150 mg/L YAN and a high at 300 mg/L YAN. The fermentation was monitored by measuring the optical density and sugar consumption. Metabolic response was tested through real-time RT-PCR of genes implicated in aroma production of esters and terpenes such as ATF1, ATF2, EEB1, EHT1, IAH1, BGL2, EXG1 and by determining the volatile composition (SPE/GC–MS) of the samples taken at four different time points of the fermentation. In terms of the volatile characterization of the wines, acetate esters, linalool and nerol appeared to be clearly distinct between the different levels of YAN, which confirms the specialization in volatile compounds production among different nitrogen concentration levels. Real-time-PCR results revealed that, the genes involved in ethyl and acetate esters production recorded, in general, higher transcript levels under high nitrogen supplementation (300 mg/L YAN). In addition, an up-regulation of the BGL2 and EXG1 genes, corresponded well to the terpenols concentration found, was observed in case of high nitrogen content. Our study revealed the impact of different nitrogen supplementations on the volatile compounds and the relative expression of specific genes. Metabolic analysis of selected volatile components of the wine aroma in conjunction with transcriptional analyses provide a great approach to orient the fermentation process towards a desirable wine aromatic profile.