Στην παρούσα Διατριβή μελετήθηκαν αυτοφυή και μεσογειακά είδη, ήτοι Anthyllis barba-jovis, Ballota acetabulosa, Clinopodium creticum, Clinopodium nepeta και Scabiosa hymettia, με στόχο την αξιοποίησή τους ως καλλωπιστικών και για αποκατάσταση τοπίου με έμφαση στο τοπίο αρχαιολογικών χώρων. Αναπτύχθηκαν πρωτόκολλα πολλαπλασιασμού με σπόρο, μικροπολλαπλασιασμό, και μοσχεύματα βλαστού και πρωτόκολλα φυτωριακής καλλιέργειας, και διερευνήθηκε η ικανότητα επιβίωσης των ειδών αυτών in situ σε αρχαιολογικούς χώρους. Στα C. creticum και C. nepeta προσδιορίστηκε συγκριτικά η απόδοση και χημική σύσταση του αιθερίου ελαίου σε φυτά υπαίθριας, θερμοκηπιακής και in vitro καλλιέργειας.
Όσον αφορά τον πολλαπλασιασμό με σπόρο, μόνο στο είδος A. barba-jovis διαπιστώθηκε φυσικός λήθαργος, ο οποίος αντιμετωπίστηκε με μηχανικό σκαριφισμό (1 min με σμυριδόχαρτο). Το εύρος των θερμοκρασιών για τη βλάστηση των σπόρων των ειδών A. barba-jovis, B. acetabulosa, C. creticum και C. nepeta κυμάνθηκε από 10 έως 30 °C, με άριστες θερμοκρασίες 15 - 20 °C, όπου η βλαστικότητα ήταν πολύ υψηλή. Η αποθήκευση των σπόρων σε θερμοκρασία δωματίου για 1 - 2 έτη δεν επέδρασσε στη βλαστικότητα, ενώ αποθήκευση πέραν των τριών ετών μείωσε τη βλαστικότητα των A. barba-jovis και B. acetabulosa. Οι σπόροι του S. hymettia εμφάνισαν πολύ χαμηλή ικανότητα βλάστησης σε ex vitro συνθήκες, ενώ σε in vitro συνθήκες η βλάστηση του σπόρου ήταν αδύνατη.
Στον in vitro πολλαπλασιασμό η εγκατάσταση καλλιέργειας του A. barba-jovis, B. acetabulosa και S. hymettia με έκφυτα προερχόμενα από ενήλικα αυτοφυή ή καλλιεργούμενα φυτά, παρουσίασε πολλές έως αξεπέραστες δυσκολίες, λόγω του υψηλού ποσοστού μολύνσεων. Εξ’ αυτών μόνο το είδος S. hymettia εγκαταστάθηκε in vitro από ενήλικα αυτοφυή φυτά, με χρήση εκφύτων κορυφής βλαστού και υποστρώματος Murashige & Skoog (MS) είτε χωρίς φυτορυθμιστικές ουσίες (PGRs) ή με 1,0 mg L-1 6-βενζυλαδενίνη (BA), ενώ το A. barba-jovis εγκαταστάθηκε από νεαρά φυτά (2 ετών) που αναπτύσσονταν σε θερμοκήπιο, επίσης σε υπόστρωμα MS με 1,0 - 1,5 mg L-1 BA. Για την εγκατάσταση in vitro καλλιέργειας από ενήλικα φυτά του C. creticum ενδείκνυται η χρήση εκφύτων κορυφής και κόμβου και υποστρώματος MS εμπλουτισμένου με 1,0 mg L-1 ζεατίνη (ΖΕΑΤ), ενώ για το συγγενικό είδος C. nepeta προτείνεται το υπόστρωμα MS εμπλουτισμένο με 1,0 mg L-1 BA.
Η εγκατάσταση in vitro καλλιέργειας A. barba-jovis, B. acetabulosa, C. creticum και C nepeta από in vitro καλλιεργούμενα σπορόφυτα, έγινε σε υψηλότατο ποσοστό, με έκφυτα κορυφής και κόμβου, σε υπόστρωμα MS είτε χωρίς PGRs ή με 0,5 - 1,0 mg L-1 BA ή ZEAT.
Κατά το στάδιο πολλαπλασιασμού των in vitro καλλιεργειών, τόσο της καλλιέργειας από σπορόφυτα, όσο και αυτής από ενήλικα ή νεαρά φυτά θερμοκηπίου των ειδών A. barba-jovis, B. acetabulosa, C. creticum και C. nepeta παρατηρήθηκε υψηλό ποσοστό αντίδρασης των εκφύτων. Η προσθήκη κυτοκινίνης στο υπόστρωμα (από 0,5 - 8,0 mg L-1), ειδικά των ΒΑ και ΖΕΑΤ και λιγότερο των κινετίνη (ΚΙΝ) και το 6-γ-γ-(διμεθυλαλληλάμινο)-πουρίνη (2iP), είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του αριθμού των βλαστών ανά έκφυτο, αναλογικά με τη συγκέντρωση αυτών, αλλά συγχρόνως επέφερε και αύξηση της υπερενυδάτωση. Στο υπόστρωμα MS με 4,0 ή 8,0 mg L-1 ΒΑ η προσθήκη της αυξίνης 1-ναφθαλινοξικό οξύ (ΝΑΑ) σε συγκέντρωση 0,1 ή 0,5 mg L-1, ή η αύξηση της συγκέντρωσης του άγαρ από 8 g L-1 σε 12 g L-1 εξάλειψε την υπερενυδάτωση με ταυτόχρονη αύξηση του αριθμού των βλαστών σε πολύ υψηλό επίπεδο και ως εκ τούτου τα υποστρώματα αυτά ενδείκνυνται για χρήση σε επιχειρηματική κλίμακα.
Για τον πολλαπλασιασμό του S. hymettia προτείνεται το υπόστρωμα MS πλήρους ή μισής δύναμης εμπλουτισμένο με 1,0 mg L-1 ΒΑ με ή χωρίς 0,1 mg L-1 ΝΑΑ, το οποίο όμως δεν ενδείκνυται για πολλαπλασιασμό του είδους σε επιχειρηματική κλίμακα λόγω του χαμηλού δυναμικού του.
Η ριζοβολία των μικρομοσχευμάτων των προαναφερθέντων ειδών που προήλθαν από την καλλιέργεια που εγκαταστάθηκε τόσο από in vitro ανεπτυγμένα σπορόφυτα όσο και από νεαρά φυτά παρουσίασαν παρόμοια συμπεριφορά και ήταν επιτυχής σε υπόστρωμα μισής δύναμης MS χωρίς ή με 0,5 - 4,0 mg L-1 σε ινδολ-3-βουτυρικό οξύ (IBA) σε συνεχή εφαρμογή για έξι εβδομάδες. Παράλληλα με τη ριζοβολία παρατηρήθηκε και έκπτυξη πλάγιων βλαστών, με αποτέλεσμα τη δημιουργία πολύκλαδων φυταρίων έτοιμων για εγκλιματισμό, με το πλεονέκτημα της αποφυγής πιθανού κορυφολογήματος για απόκτηση συμπαγούς φυτού. Για τα είδη A. barba-jovis και B. acetabulosa διερευνήθηκε και ο τύπος του μικρομοσχεύματος, ήτοι μόσχευμα κορυφής μικροβλαστού ή μέσης, όπου δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στη ριζοβολία τους. Επιπρόσθετα διερευνήθηκε η in vitro ριζοβολία συστάδων μικροβλαστών του B. acetabulosa, C. creticum και C. nepeta, η οποία ήταν επιτυχής σε υπόστρωμα μισής δύναμης MS χωρίς ΙΒΑ. Τέλος για το είδος S. hymettia για την in vitro ριζοβολία των μικρομοσχευμάτων προτείνεται υπόστρωμα μισής δύναμης MS με 1,0 mg L-1 ΙΒΑ σε συνεχή εφαρμογή για έξι εβδομάδες.
Ο εγκλιματισμός των φυταρίων όλων των ειδών σε ex vitro συνθήκες έγινε με πολύ υψηλά ποσοστά επιτυχίας (80 - 100%) σε μίγμα τύρφης – περλίτη (1:1, v/v).
Σε ότι αφορά στη ριζοβολία μοσχευμάτων βλαστού, δοκιμάστηκε λήψη μοσχευμάτων στις τέσσερις εποχές του έτους και μεταχειρίσεις με αυξίνη είτε σε μορφή σκόνης για ποώδη/ημι-ξυλώδη ή ξυλώδη μοσχεύματα ή σε αλκοολούχο υδατικό διάλυμα (0 - 3000 mg L-1 ΙΒΑ για 1 ή 5 min.). Ο πολλαπλασιασμός του A. barba-jovis με μοσχεύματα βλαστού ήταν ανεπιτυχής, σε όλες τις εποχές και σε όλες τις μεταχειρίσεις που δοκιμάστηκαν, αντίθετα η ριζοβολία των μοσχευμάτων της C. creticum και C. nepeta έγινε με απόλυτη σχεδόν επιτυχία σε όλες τις μεταχειρίσεις και σε όλες τις εποχές. Στο ποσοστό ριζοβολίας μοσχευμάτων των ειδών B. acetabulosa και S. hymettia παρατηρήθηκε εποχική διακύμανση. Πιο συγκεκριμένα, υψηλότερα ποσοστά ριζοβολίας παρατηρήθηκαν στα μοσχεύματα B. acetabulosa που συλλέχθηκαν την άνοιξη και το φθινόπωρο, για το είδος S. hymettia το φθινόπωρο και το χειμώνα, ενώ αντιθέτως το καλοκαίρι ήταν η πλέον ακατάλληλη εποχή για τη ριζοβολία των μοσχευμάτων και των δύο ειδών. Όσον αφορά τη συγκέντρωση του ΙΒΑ, για το είδος Β. acetabulosa, την άνοιξη προτείνεται συγκέντρωση 2000 mg L-1, για 1 min, ενώ το φθινόπωρο για 5 min. Για το είδος S. hymettia τόσο το φθινόπωρο όσο και το χειμώνα προτείνεται συγκέντρωση 1000 mg L-1 για 1 min ή εφαρμογή σκόνη ριζοβολίας για ξυλώδη μοσχεύματα.
Για την περαιτέρω ανάπτυξη των φυταρίων όλων των ειδών προτείνεται η χρήση υποστρώματος τύρφης: περλίτη (2:1, v/v) και η λίπανση με χαμηλή συγκέντρωση (2 g L-1) ισορροπημένου λιπάσματος (20:20:20) ανά μήνα. Επιπλέον για τα είδη Β. acetabulosa, C. creticum και C. nepeta για την παραγωγή διακλαδισμένων φυταρίων, τα οποία θα είναι πιο ελκυστικά στους καταναλωτές ενδείκνυται η εφαρμογή κορυφολογήματος.
Όσον αφορά την εγκατάσταση των ειδών στους αρχαιολογικούς χώρους, το είδος B. acetabulosa έδειξε τη μεγαλύτερη προσαρμοστικότητα σε όλη την Ελλάδα, ενώ το S. hymettia εγκαταστάθηκε επιτυχώς στις μη παράκτιες περιοχές. Το C. nepeta εγκαταστάθηκε καλύτερα στη Β. Ελλάδα, ενώ το C. creticum στη Νότια Ελλάδα. Επιπρόσθετα παρατηρήθηκε ότι η χρήση γεωυφάσματος για τον έλεγχο των ζιζανίων και η εφαρμογή αραιών αρδεύσεων κατά τη διάρκεια της θερμής και ξηρής περιόδου του καλοκαιριού συνέβαλαν στην αποτελεσματικότερη εγκατάσταση όλων των φυτικών ειδών.
Η απόδοση αιθερίου ελαίου ήταν υψηλότερη στα φυτά C. creticum και C. nepeta που καλλιεργήθηκαν υπαίθρια σε σύγκριση με τα θερμοκηπιακά. Η υψηλότερη απόδοση αιθερίου ελαίου και για τα δύο είδη ανεξαρτήτως θέσης καλλιέργειας καταγράφτηκε τον Αύγουστο (περίοδος ανθοφορίας), ενώ η χαμηλότερη το Φεβρουάριο (βλαστική περίοδος).
Τα in vitro φυτάρια και των δύο ειδών (σε βλαστική κατάσταση) έδωσαν υψηλότερη απόδοση αιθερίου ελαίου σε σχέση με τα ex vitro φυτά, υπαίθρια ή θερμοκηπιακά του Φεβρουαρίου. Αναφορικά με την ποιοτική σύσταση του αιθερίου ελαίου, η κύρια χημική ομάδα που ανιχνεύτηκε στο αιθέριο έλαιο και των δύο ειδών ήταν τα οξυγονωμένα μονοτερπένια, ακολουθούμενη από τους μονοτερπενικούς υδρογονάνθρακες και τα σεσκιτερπένια. Στους κύριους εκπροσώπους των χημικών ομάδων παρατηρήθηκε επίσης εποχική διακύμανση και στις δύο θέσεις ex vitro καλλιέργειας (αγρός, θερμοκήπιο) και για τα δύο υπό μελέτη είδη. Η συγκριτική μελέτη της σύστασης των αιθερίων ελαίων από in vitro αναπτυγμένους μικροβλαστούς και από ex vitro καλλιεργούμενα φυτά, έδειξε μεγάλη ομοιότητα μεταξύ των δύο χημικών προφίλ τόσο για το είδος C. creticum όσο και για το είδος C. nepeta.
Συνοψίζοντας, η παρούσα Διατριβή ανέδειξε πέντε είδη αυτοφυών φυτών της Μεσογείου, με πρωτόκολλα πολλαπλασιασμού και φυτωριακής καλλιέργειας, έτοιμα για εισαγωγή στην επιχειρηματική ανθοκομία και στην Αρχιτεκτονική του Τοπίου, στα πλαίσια της γενικά αποδεκτής πλέων τάσης των τελευταίων ετών, χρήσης αυτοφυών φυτών σε κηποτεχνικές διαμορφώσεις και αναπλάσεις τοπίου, με στόχο τη βιοποικιλότητα, την ανθεκτικότητα και τη διατήρηση του χαρακτήρα του τοπίου.
In the present Thesis Mediterranean and native species were studied, i.e, Anthyllis barba-jovis, Ballota acetabulosa, Clinopodium creticum, Clinopodium nepeta and Scabiosa hymettia, aiming to their introduction as ornamentals plants and in landscape restoration with emphasis on the landscape of archeological sites. Propagation protocols were developed with seed, micropropagation and stem cuttings, and protocols for nursery cultivation; the survival of these species was investigated in situ in archeological sites. The yield and chemical composition of the essential oil of C. creticum and C. nepeta were also studied in plants grown in the field, greenhouse and in vitro.
As regards seed propagation, A. barba-jovis out of all species was found to have physical dormancy (coat-imposed dormancy) that was overcome by mechanical scarification (with sandpaper for 1 min). Cardinal germination temperatures of A. barba-jovis, B. acetabulosa, C. creticum and C. nepeta ranged from 10 to 30 ° C; optimum temperatures ranged from 15 - 20 °C, with high germination percentages. Storage of seeds at room temperature for 1 - 2 years did not affect the germination, while storage over 3 years reduced the germination of A. barba-jovis and B. acetabulosa. Seeds S. hymettia showed very low germination ability in ex vitro conditions, while in vitro seeds failed to germinate.
In vitro propagation of A. barba-jovis, B. acetabulosa and S. hymettia took place starting either from adult or from cultivated plants, facing major difficulties due to high percentages of contamination. Only in S. hymettia was possible to establish in vitro cultures from adult wild plants, using shoot tip explants, on Murashige & Skoog (MS) medium, either without plant growth regulator(s) (PGRs) or with 1.0 mg L-1 6-benzylladenine (BA). A. barba-jovis in vitro cultures were established starting from young plants (2 years old), growing in a greenhouse, also on an MS medium supplemented with 1.0 - 1.5 mg L-1 BA. For in vitro culture starting from adult C. creticum plants the use of shoot tip or nodal explants and MS medium enriched with 1.0 mg L-1 zeatin (ZEAT) is recommended. For the related species C. nepeta the use of MS medium enriched with 1.0 mg L-1 BA is suggested.
The establishment of in vitro cultures of A. barba-jovis, B. acetabulosa, C. creticum and C. nepeta from in vitro grown seedlings was performed at highest percentages, with shoot tip and nodal explants, on MS medium either without PGRs or with 0.5 - 1.0 mg L-1 BA or ZEAT.
During the multiplication phase of A. barba-jovis, B. acetabulosa, C. creticum and C. nepeta, in vitro cultures of seedling, adult or young-greenhouse plant origin had high explant-response percentage. The addition of cytokinin to the medium (from 0.5 - 8.0 mg L-1), especially of BA and ZEAT and less of kinetin (KIN) and 6-γ-γ- (dimethylallamino)-purine (2iP), resulted to the increase of shoot number per explant, analogous to their concentration, but simultaneously led to an increase in hyperhydration. In the MS medium with 4.0 or 8.0 mg L-1 BA the addition of auxin 1-Naphtheleneacetic acid (NAA) at a concentration of 0.1 or 0.5 mg L-1 or an increase in the concentration of agar from 8 g L-1 to 12 g L-1 eliminated hyperhydration and simultaneously increased the shoot number to a very high level. Therefore, these media are appropriate for use on a business scale.
For the multiplication of S. hymettia the use of MS medium, full or half strength, enriched with 1.0 mg L-1 BA with or without 0.1 mg L-1 NAA, is recommended, but it is not appropriate for multiplication of the species on a business scale due to of its low multiplication index.
Rooting of all species micro-cuttings, derived from in vitro cultures stablished from seedlings and young plants, exhibited similar behavior and rooting was successful on half-strength MS medium without or with 0.5 - 4.0 mg L-1 indole-3-butyric acid (IBA) in continuous application for six weeks. Along with rooting, the development of lateral shoots, resulting in the formation of a multi-branched plantlet for acclimatization, with the advantage of avoiding possible pruning for the acquisition of a compact plant. In A. barba-jovis and B. acetabulosa the type of micro-cutting depending on its position on the micro-shoot was also investigated as for its rooting capacity; shoot tip or below tip cuttings did not differ in their rooting. In addition, the in vitro rooting of microshoot clusters of B. acetabulosa, C. creticum and C. nepeta was investigated, which was successful on half-MS medium without IBA. Finally, in vitro rooting of S. hymettia micro-cuttings was successful on half-strength MS medium with 1.0 mg L-1 IBA in continuous application for six weeks.
The acclimatization of plantlets of all the species in ex vitro conditions was highly successful (80 - 100%) in a mixture of peat - perlite (1: 1, v / v).
As regards rooting of stem cuttings, the effect of four seasons was tested in conjunction with auxin either in powder form for herbaceous/softwood or for hardwood cuttings or in an ethanol-water solution (0 - 3000 mg L-1 IBA for 1 or 5 min). The propagation of A. barba-jovis with stem cuttings was unsuccessful, in all seasons and in all treatments. On the contrary the rooting of C. creticum and C. nepeta cuttings occurred with complete success, in all treatments and seasons. Seasonal variability was observed in the rooting percentage of B. acetabulosa and S. hymettia. More specifically, higher rooting percentages were observed in B. acetabulosa cuttings collected in spring and autumn, for S. hymettia in autumn and winter, while summer was the most unsuitable season for rooting cuttings of both species. Concerning the IBA concentration, for B. acetabulosa 2000 mg L-1 is suggested applied for 1 min in spring and 5 min in autumn, while for S. hymettia, both in autumn and winter a concentration of 1000 mg L-1 for 1 min or application of rooting powder for hardwood cuttings is recommended.
For further growth of rooted cuttings of all species, is recommended to use a mixture of peat: perlite (2:1, v / v) and low concentration (2 g L-1) of a water-soluble fertilizer (Nutrileaf 60, 20:20:20) per month. In addition, the application of pruning is recommended for B. acetabulosa, C. creticum and C. nepeta for the production of branched plants, which will be more attractive to consumers.
Regarding the installation of the species in the archeological sites, B. acetabulosa showed the greatest adaptability, while S. hymettia was successfully established in the non-coastal areas. C. nepeta was established better in northern Greece, while C. creticum in southern Greece. In addition, it was observed that the use of geotextile for weed control and the application of sparse irrigation during the hot and dry period of summer contributed to the more efficient establishment of all plant species.
Essential oil yield was highest in C. creticum and C. nepeta plants grown in the field compared to those in the greenhouses. The highest yield of essential oil for both species regardless their cultivation position was recorded in August (flowering period), while the lowest in February (vegetative period). The in vitro plantlets of both species (in vegetative condition) gave higher yield of essential oil than the ex vitro, field or greenhouse plants, in February. Regarding the qualitative composition of the essential oil, the main chemical group detected in the essential oil of both species was oxygenated monoterpenes, followed by monoterpene hydrocarbons and sesquiterpenes. The main representatives of chemical groups presented seasonal variation in both ex vitro culture sites (field and greenhouse) for both species under study. The comparative study of the composition of essential oils from in vitro developed microshoots and ex vitro cultivated plants showed a great similarity between their chemical profiles for both C. creticum and C. nepeta.
To summarize, this Thesis highlighted five species of native plants of the Mediterranean, with propagation and nursery protocols, ready for introduction to horticultural practice and landscape architecture, in the context of generally accepted trend in recent years that is the use of native plants in gardening and landscaping, aiming at biodiversity, resilience and maintaining the character of the landscape.
