Evaluation of selected peptide macrocycles as inhibitors of the disease-related aggregation of the protein TDP-43

Abstract

TAR DNA binding protein 43 (TDP-43) is a vital and versatile RNA/DNA binding protein which is aggregation prone. Ubiquitinated cytoplasmic inclusions containing TDP-43 and its C-terminal fragments are pathological hallmarks of numerous neurodegenerative diseases including Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS). Specifically, more than 97% of patients with ALS present TDP-43 protein deposited in neuronal cytoplasmic inclusions suggesting its pivotal role in ALS pathology. The variety of TDP-43 related neurodegenerative diseases, indicate that TDP-43 has a more wide-spread and vital role in the general process of neuro-degeneration. The main objective of this thesis, was the evaluation of the ability of selected pentapeptides to inhibit the aggregation of TDP-43 in vitro. To do so, TDP-43 protein with or without fusion with GFP was cloned and overexpressed in BL21(DE3) cells. TDP-43 protein was subsequently purified by nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-Nta) affinity chromatography and tandem size exclusion chromatography (SEC). Aggregation assays, turbidity and sedimentation assays were performed in the presence or absence of two selected cyclic pentapeptides in order to monitor any changes in TDP-43 aggregation propensity. These selected pentapeptides were evaluated for their ability to inhibit the aggregation of TDP-43 protein and thus, preventing the formation of its neurotoxic inclusions that contribute to the degeneration of motor neurons and development of ALS. TDP-43 may hold the key to finding common therapeutics, applicable to a multitude of neurodegenerative diseases. It was shown that TDP-43 is indeed aggregation prone, and its Q331K mutant fused with GFP is more rapidly aggregated than wild type (WT). Furthermore, as observed, there was no inhibition of aggregation by the two cyclic pentapeptides selected, TAFDR and TTYAR.

Η TAR πρωτεΐνη δέσμευσης DNA 43 (TDP-43) είναι μία πολυδιάστατη πρωτεΐνη ζωτικής σημασίας η οποία παρουσιάζει τάση συσσωμάτωσης. Ουβικουιτινιωμένα κυτταροπλασματικά συσσωματώματα που περιέχουν την πρωτεΐνη TDP-43 και τα καρβοξυτελικά της θραύσματα αποτελούν σήμα κατατεθέν πολλών νευροεκφυλιστικών ασθενειών συμπεριλαμβανομένης της Πλάγιας Μυοτροφικής Σκλήρυνσης (ALS). Συγκεκριμένα, πάνω από το 97% των ασθενών με ALS έχουν κυτταροπλασματικά συσσωματώματα στους νευρώνες τους που περιέχουν συσσωματωμένη TDP-43 πρωτεΐνη, πράγμα που φανερώνει τον καθοριστικό της ρόλο στην παθολογία της ALS. H πληθώρα των νευροεκφυλιστικών ασθενειών που συνδέονται με την TDP-43, δείχνουν πως η TDP-43 έχει έναν διαδεδομένο και καθοριστικό ρόλο στην γενικότερη διαδικασία του νευροεκφυλισμού. Κύριος στόχος αυτής της διπλωματικής, ήταν η αξιολόγηση της ικανότητας επιλεγμένων πενταπεπτιδίων στην αναστολή της συσσωμάτωσης της TDP-43 in-vitro. Προκειμένου να γίνει αυτό η πρωτεΐνη TDP-43 με ή χωρίς τη χίμαιρα με GFP κλωνοποιήθηκε και υπερεκφράστηκε σε κύτταρα BL21(DE3). Έπειτα, η πρωτεΐνη TDP-43 απομονώθηκε με χρωματογραφία συγγένειας Νίτρο-νιτριλοτριοξιού οξέος (Ni-Nta) και χρωματογραφία μοριακής διήθησης (SEC). Δοκιμές συσσωμάτωσης: θολερότητα και δοκιμές καθίζησης, έγιναν υπό την παρουσία και την απουσία δύο κυκλικών πενταπεπτιδίων ώστε να ελέγξουν τις μεταβολές στην τάση συσσωμάτωσης της TDP-43. Αυτά τα επιλεγμένα πενταπεπτίδια αξιολογήθηκαν για την ικανότητά τους να αναστείλουν τη συσσωμάτωση της TDP-43 πρωτεΐνης και έτσι να αποτρέψουν τον εκφυλισμό των κινητικών νευρώνων και την ανάπτυξη του ALS. Η TDP-43 μπορεί να αποτελεί το κλειδί στην ανακάλυψη κοινών θεραπειών που να μπορούν να εφαρμοστούν σε διαφορετικές νευροεκφυλιστικές ασθένειες. Αποδείχθηκε πως είναι πράγματι μία πρωτεΐνη που έχει την τάση να συσσωματώνεται και η Q331K μεταλλαγή της μαζί με την GFP συσσωματώνεται ακόμη γρηγορότερα από την αγρίου τύπου πρωτεΐνη (WT). Επίσης, παρατηρήθηκε πως δεν υπάρχει αναστολή της συσσωμάτωσης από τα δύο πενταπεπτίδια που επιλέχθηκαν, το TAFDR και το TTYAR.