Ανίχνευση Ζώντων αλλά Μη Καλλιεργήσιμων Κυττάρων (Viable But Non-Culturable) του παθογόνου μικροοργανισμού Listeria monocytogenes ύστερα από έκθεση σε διαφορετικές συγκεντρώσεις του υποχλωριώδους νατρίου με τη χρήση Aλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο με μονοαζίδιο του προπιδίου (PMA- qPCR) και Μικροσκοπίας Φθορισμού (Fluorescence microscopy)

Abstract

Οι επιστήμονες έχουν αποδείξει ότι η έκθεση της L. monocytogenes σε απολυμαντικά επάγει διάφορες καταστάσεις στον πληθυσμό, όπως είναι π.χ. ο υποθανάτιος τραυματισμός, η ανθεκτικότητα, η επαγωγή της κατάστασης VBNC. Σε αυτές τις καταστάσεις, τα κύτταρα έχουν τη δυνατότητα να ανακάμψουν και να αποτελέσουν δυνητικά κίνδυνο για την ασφάλεια των καταναλωτών. Οι στόχοι της μελέτης ήταν να διερευνηθεί η πιθανή επαγωγή της κατάστασης VBNC κατά την έκθεση σε SH, να υπολογιστεί το ποσοστό των μεταβολικά ενεργών, των τραυματισμένων, των VBNC και των νεκρών κυττάρων, χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού (Fluorescence Microscopy-FM) σε συνδυασμό με χρώση CFDA/PI, να ανιχνευτούν φαινότυποι που σχετίζονται με την ανθεκτικότητα των κυττάρων (Size Colony Variations- SCVs), και να συγκρίνουν τα αποτελέσματα σχετικά με τη βιωσιμότητα των κυττάρων μεταξύ των PMA-qPCR και FM. Ένας πληθυσμός 7 x 109 CFU/mL του στελέχους Scott A υποβλήθηκε σε οξειδωτική καταπόνηση, χρησιμοποιώντας το απολυμαντικό διάλυμα SH στις συγκεντρώσεις 200, 250 και 300 ppm SH και για 3 ώρες στους 20 oC. Τα δείγματα καλλιεργήθηκαν σε δύο θρεπτικά υποστρώματα, το γενικό TSAYE και το επιλεκτικό TSAYE με 5% w/v NaCl. Η εμφάνιση του υποθανάτιου τραυματισμού εκτιμήθηκε, συγκρίνοντας τα τρυβλία με TSAYE με τα TSAYE με 5 % w/v NaCl. Το ποσοστό των μεταβολικά ενεργών, των νεκρών και των τραυματισμένων βακτηρίων προσδιορίστηκε με τη FM. Η ανίχνευση της κατάστασης VBNC επιτελέστηκε μέσω της παράλληλης αξιολόγησης της καλλιεργησιμότητας και της μεταβολικής ενεργότητας των κυττάρων, που προέκυψε από τη μέθοδο των τρυβλίων και τη FM αντίστοιχα. Τέλος, το ποσοστό των ζωντανών κυττάρων των δειγμάτων εκτιμήθηκε με τη PMA-qPCR. Η έκθεση των κυττάρων σε 200 και 250 ppm SH για 3 ώρες είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγή της κατάστασης VBNC, καθώς το καλλιεργήσιμο κλάσμα των κυττάρων ήταν χαμηλότερο σε σύγκριση με τα βιώσιμα κύτταρα που ανιχνεύθηκαν με FM και PMA-qPCR. Δυο υποπληθυσμοί διακρίθηκαν στο TSAYE κατά την έκθεση σε 200 ppm SH, έναν με φαινότυπο που αναπτύσσεται φυσιολογικά, παρά την έκθεση του στο απολυμαντικό και έναν με φαινότυπο που εμφάνιζε μικρότερο μέγεθος αποικιών (SCVs). Η συγκέντρωση των 300 ppm ήταν πιο αποτελεσματική στη θανάτωση όλων των διαφορετικών παρατηρούμενων κλασμάτων του πληθυσμού. Ακόμη, τραυματισμένα κύτταρα παρατηρήθηκαν μόνο με τη μέθοδο των τρυβλίων. Όσο αυξανόταν η συγκέντρωση του SH, τόσο πιο γρήγορα στο χρόνο εμφανιζόταν ο υποθανάτιος τραυματισμός. Τέλος, η FM ήταν πιο ακριβής μέθοδος για την ανίχνευση της κατάστασης VBNC συγκριτικά με τη PMA-qPCR. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματά της παρούσας μελέτης είναι πιθανό να μας βοηθήσουν στον αξιόπιστο εντοπισμό της κατάστασης VBNC κατά τον ποιοτικό έλεγχο των τροφίμων, προλαμβάνοντας ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα που μπορεί να οδηγήσουν σε απειλές για τη δημόσια υγεία.

L. monocytogenes, as a foodborne pathogenic bacterium, is considered as major causative agent responsible for serious diseases, especially for pregnant women, immunocompromised patients and children. Proper disinfection plays a vital role in protecting human health from outbreaks, caused by L. monocytogenes. Exposure of L. monocytogenes to sublethal stresses, like sublethal sublethal concentrations of sodium hypochlorite (SH), related with food processing environments may induce different physiological states, i.e. sublethal injury, persistence, viable but non culturable (VBNC) state, with varying resuscitation capacity. Bacterial heterogeneity, injury and VBNC state-limitations may lead to undetected hazards, causing foodborne outbreaks or be the reason for insufficient evidence to enable source attribution. The objectives of the present study were to investigate potential VBNC induction during exposure to sodium hypochlorite, to outline the proportion of metabolically active, sublethally injured, VBNC and dead cells using fluorescence microscopy coupled with CFDA/PI staining, to identify size colony variations (SCVs) associated with persistence and to compare the results regarding cell’s viability from PMA-qPCR and fluorescence microscopy (FM). A population of 7 x 109 CFU/mL of the Scott A strain was subjected to oxidative stress, using sodium hypochlorite at concentrations 200, 250 and 300 ppm SH and for 3 hours at 20 oC. Samples were collected every hour with starting point the 0 h and were cultured in two growth mediums, the general TSAYE and the selective TSAYE with 5% w/v NaCl. Sublethal injury was assessed by comparing the results (CFU/ml) from two different medium plates. Suspended cells were stained by adding CFDA/PI and percentages of metabolically active, sublethally injured and dead cells were calculated. The detection of VBNC was performed by comparing plate counts with the results from FM. In addition, percentages of viable cells were estimated by PMA-qPCR. Treatment with SH 200 and 250 ppm for 3 h resulted in the induction of the VBNC state as the culturable fraction of cells was lower compared to the viable cells detected with FM and PMA-qPCR. Exposure to 200 ppm SH at 20oC, resulted in two sub-populations on TSAYE, one with the phenotype of untreated cells and one resembling SCVs for both biological replications. Sublethally injured cells were observed only by culture-based method. Sublethal injury was observed earlier during the exposure to 250 and 300 ppm rather than 200 ppm SH. Comparing the results from FM and PMA-qPCR, FM was more accurate method to detect VBNC state rather than PMA-qPCR. In conclude, our results may assist in the reliable detection of the VBNC state during food quality control, preventing false-negative results that may lead to public health threats.