Ιn situ μελέτη υποθανάτιου τραυματισμού μεμονωμένων κυττάρων Listeria monocytogenes σε λουκάνικα τ. Φρανκφούρτης ένεκα θερμικής ή όξινης καταπόνησης

Abstract

Τα λουκάνικα τύπου Φρανκφούρτης αναγνωρίζονται από τον FDA και το USDA ως προϊόν πολύ υψηλού κινδύνου για την πρόκληση λιστερίωσης, όταν καταναλώνονται χωρίς να προηγηθεί αναθέρμανσή τους. Η ικανότητα του παθογόνου Listeria monocytogenes να επιβιώνει μετά από θερμική καταπόνηση έχει ήδη διαπιστωθεί σε προηγούμενες μελέτες. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η χωρική κατανομή των κυττάρων του παθογόνου στη μεμβράνη του τροφίμου μετά από θέρμανση στους 64οC με συνεστιακή μικροσκοπία φθορισμού και βρέθηκε υψηλότερη συγκέντρωση ζωντανών κυττάρων σε βαθύτερα στρώματα της μεμβράνης, υποδεικνύοντας ότι η μικροδομή του τροφίμου επιτρέπει στο παθογόνο να προστατεύεται κατά τη θερμική επεξεργασία. Επιπλέον, μελετήθηκε η απόκριση του παθογόνου σε συνθήκες προσομοίωσης πέψης. Αρχικά, έγινε συγκριτική μελέτη της όξινης καταπόνησης in situ σε δύο επίπεδα pH (1,5 και 2,5), για τρία διαφορετικά διαλύματα καταπόνησης (Simulated Gastric Fluid, SGF 1/3 strength και Ringer/HCl) σε δυναμικές (μεταβολή του pH) και σε στατικές (επαναφορά του pH στην αρχική τιμή) συνθήκες. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μεταβολή του pH λόγω της προσθήκης του τροφίμου και η παρουσία αδιάλυτων στερεών συστατικών στο διάλυμα καταπόνησης καθορίζουν το ρυθμό θανάτωσης του παθογόνου. Σε pH 1,5 παρατηρήθηκε δραματική μείωση του βακτηριακού πληθυσμού, ενώ το χειρότερο σενάριο, που προσομοιάζει τις συνθήκες του στομάχου μετά από κατανάλωση γεύματος, αφορούσε στην έκθεση σε διάλυμα SGF με αρχικό pH 2,5 που έφτασε την τιμή 3,5 μετά από 60 λεπτά. Στην περίπτωση αυτή δεν καταγράφηκε στατιστικά σημαντική μείωση του πληθυσμού. Ο υποθανάτιος τραυματισμός μελετήθηκε in situ σε διάλυμα HCl σε Ringer με pH 2,5 σε στατικές συνθήκες, με μικροβιολογικές μεθόδους επίστρωσης σε γενικά και ειδικά υποστρώματα και με διαφορική χρώση των κυττάρων και μικροσκοπία φθορισμού. Και με τις δύο μεθόδους δεν παρατηρήθηκε υποθανάτιος τραυματισμός των κυττάρων. Εντούτοις, από την ανάλυση των εικόνων μικροσκοπίας φθορισμού υπολογίστηκε υψηλότερο επίπεδο ζωντανών κυττάρων από αυτό που καταγράφηκε μέσω της επίστρωσης σε γενικό θρεπτικό υπόστρωμα. Τέλος, εύρημα της παρούσας εργασίας αποτέλεσε η συσσωμάτωση των κυττάρων της L.monocytogenes σε χαμηλό pH, πιθανώς λόγω ελάττωσης του επιφανειακού τους φορτίου, και η αποσυσσωμάτωσή τους σε υψηλότερο pH (π.χ. pH 6,5).

Non reheated frankfurters are ranked as a product of very high relative risk for foodborne listeriosis by the FDA and USDA. Previous research has shown that the pathogen Listeria monocytogenes can survive thermal treatment. The present study focused on the spatial distribution of the cells on frankfurters’ casings after heat treatment at 64oC using confocal fluorescence microscopy. Higher concentration of live cells was observed in deeper layers of the casings, showing that the food microstructure plays a significant role in heat protection of the cells. Moreover, the survival of the pathogen during simulation of digestion was assessed. First, a comparative study of in situ acid stress tests was conducted, including microbial response in two pH levels (1.5 and 2.5), using three different simulated gastric solutions (Simulated Gastric Fluid, SGF 1/3 strength and Ringer/HCl) under dynamic (increase in pH) or static (re-acidification of the solution to reach the initial pH value) conditions. The data obtained reveals that the increase in pH due to the addition of the frankfurters in the acid solution and undissolved solid particles of the solution determine the microbial rate of death. After exposure of the cells in solution adjusted to pH 1.5, the population drastically diminished, while the worst-case scenario, simulating stomach conditions after meal intake, referred to exposure to SGF solution with initial pH 2.5, reaching the pH value 3.5 after 1 hour. In this case, there was no statistically significant decrease in population levels reported. Sublethal injury was studied in situ in Ringer/HCl solution adjusted to pH 2.5 under static conditions using standard plate counting methods on general-purpose and selective media or staining of the cells and fluorescence microscopy. Both methods showed no cell injury. However, higher levels of live cells were reported by fluorescence microscopy image analysis compared to colonies counted on agar media. Lastly, another find of the present study was the aggregation of L. monocytogenes cells when exposed to highly acidic environment, probably due to a decrease in net surface potential, which was reversed in higher pH conditions (e.g., pH 6.5).