Μελέτη της επίδρασης της πρωτεΐνης νέκρωσης και παραγωγής αιθυλενιου (VdNEP) του μύκητα Verticillium dahliae στην παθογένειά του

Abstract

Ο μύκητας Verticillium dahliae προσβάλλει πλήθος ετήσιων και πολυετών καλλιεργειών παγκοσμίως, προκαλώντας σημαντικές απώλειες με οικονομικό κόστος. Στο οπλοστάσιο του μύκητα συμπεριλαμβάνονται μεταβολίτες και τοξίνες όπου εκκρίνονται και τελικά στοχεύουν στην απόφραξη του αγγειακού συστήματος του φυτού. Οι NLPs (Nep1-like proteins) έχουν χαρακτηριστεί ως πρωτεΐνες νέκρωσης και επαγωγής αιθυλενίου. H παρουσία τους έχει επιβεβαιωθεί σε πολλούς μύκητες, ωομύκητες και βακτήρια, φυτοπαθογόνα και μη. Δεδομένα στηρίζουν ότι έχει καθοριστικό ρόλο στην παθογένεια, με επικρατέστερη την άποψη ότι οι NLPs έχουν διαφορετικούς ρόλους στους διάφορους ξενιστές. Η έκφρασή τους in planta ενεργοποιούν τους μηχανισμούς άμυνας.Η NLP του μύκητα Verticillium dahliae ονομάζεται VdNEP. Είναι ισχυρός ενεργοποιητής της άμυνας σε φυτά, επάγοντας τοπικές νεκρώσεις και μαράνσεις όπως αποδείχθηκε με πειράματα εφαρμογής της πρωτεïνης σε φυτά είτε καθαρής, είτε μέσω ετερόλογης έκφρασης. Στο παρόν πείραμα ο ρόλος της VdNEP διερευνήθηκε με δύο τρόπους. Με την μελέτη της επίδρασης της υπερέκφρασης της VdNEP, σε πείραμα παθογένειας με υπερεκφράζοντα ως προς την VdNEP στελέχη, αλλά και με την έκφρασή της VdNEP-GFP μέσω του ιικόυ φορέα ΤRV με την βοήθεια του Agrobacterium tumefaciens. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε πείραμα παθογένειας σε φυτά τομάτας, όπου η VdNEP υπερεκφράζεται σε τρία στελέχη, τα 22V, 25V και 70V. Στα μεταλλαγμένα στελέχη 25V6NEP77, 70V6NEP1 και 70V6NEP3 παρατηρήθηκε μία καθυστέρηση στην εξέλιξη των συμπτωμάτων, χωρίς ωστόσο να ξεπερνάν την ένταση της ασθένειας που προκάλεσαν τα άγρια στελέχη σύμφωνα με το AUDPC, γεγονός που συμφωνούσε και με την ποσοτικοποίηση της βιομάζας των στελεχών αυτών μέσω qPCR. Σημαντική αύξηση, ωστόσο, παρατηρήθηκε στο στέλεχος 22V6NEP12 και 22V6NEP16 με το AUDPC να είναι μεγαλύτερο από το άγριο στέλεχος, όπου επίσης συμφωνούσε με την qPCR. Τα παραπάνω, οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η υπερέκφραση του VdNEP έχει έντονο αντίκτυπο στα στελέχη όπου δεν προκαλούν έντονα συμτπώματα στην τομάτα ,όπως στο στέλεχος 22V, διευρύνοντας τον κύκλο των ξενιστών του στελέχους. H μελέτη της VdNEP-GFP, δεν έδωσε ικανοποιητική εικόνα. Φυτά καπνού στα οποία πραγματοποιήθηκε αγροδιήθηση με τον δυαδικό φορέα TRV με την VdNEP-GFP δεν ανταποκρίθηκαν ούτε με τοπική νέκρωση, αλλά ούτε και με διασυστηματική μετακίνηση, όπως ήταν αναμενόμενο από αντίστοιχες μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί. Στα φυτά πιπεριάς προκλήθηκαν τοπικές νερκώσεις στις 7 ημέρες μετά την αγροδιήθηση, χωρίς να παρατηρηθούν διασυστηματικά συμπτώματα νέκρωσης, υποδεικνύοντας ότι η VdNEP-GFP δεν κινήθηκε διασυστηματικα μέσω του ιικού φορέα, όπως απέδειξαν και οι εικόνες από την παρατήρηση με συνεστειακό μικροσκόπιο. Αντίθετα, στα φυτά τομάτας, πέραν των συμπτωμάτων τοπικής νέκρωσης στον ίδιο χρόνο με αυτά τις πιπεριάς, εντοπίστηκε η VdNEP-GFP σε σημεία διαφορετικά από τα σημεία έγχυσης, όπως στον βλαστό και τη ρίζα, περιμετρικά των κυττάρων.

Verticillium dahliae wilt in a wide range of crops worldwide causing significant economic loss. It is reported to produce and secrete toxins and metabolites that target xylem vessels and finally block them. NLPs (Nep1-like proteins) have been recognized as proteins that induce necrosis and production of ethylene. They are present in many fungi, oomycetes, and bacteria pathogenic or non-pathogenic. Μany experimental data indicate that have significant role in pathogenicity and different roles in different hosts. If expressed in planta they trigger plant defenses. The NLP of Verticillium dahliae, called VdNEP, has a high activity of triggering plant resistance mechanisms. Also, it causes necrotic spots and wilting after infiltration of pure protein or through heterologous expression. In the present study, we demonstrate the role of VdNEP in two different approaches. First, we examined pathogenicity on three pathotypes that overexpress the VdNEP gene. Also, we demonstrate the in planta overexpression of VdNEP-GFP via a disarmed TRV vector by using the agroinfiltration technique. A pathogenicity experiment was carried out in tomato plants, where VdNEP is overexpressed in three strains, 22V, 25V and 70V. A delay in the symptoms’ development in the mutant strains 25V6NEP77, 70V6NEP1 and 70V6NEP3 was observed, however, it didn’t exceed the disease’s intensity caused by the wild type strains, according to the AUDPC, a fact that was also in agreement with these strains’ biomass quantification with qPCR. A significant increase in AUDPC was observed in strain 22V6NEP12 and 22V6NEP16, where it appeared to be greater than the one in the wild stain, which was also in agreement with the qPCR’s results. All the above lead to the conclusion that VdNEP’s overexpression has a strong impact on the strains that do not cause intense symptoms in tomatoes, as in strain 22V, a fact that leads to the expansion of the strain’s host range. The VdNEP-GFP study was not satisfactory. Tobacco plants were agroinfiltrated with the TRV binary vector with VdNEP-GFP and they did not respond to either local necrosis or systemic movement, as expected according to cited studies that have been performed. Local necrosis was induced in pepper plants 7 days after agroinfiltration, with no systemic necrosis symptoms, highlighting the fact that VdNEP-GFP was not transported by the viral vector, as demonstrated by confocal microscopy images. Local necrosis was also induced in tomato plants at the same time as the pepper’s symptoms, but in tomatoes, VdNEP-GFP located in other places other than the injection sites, such as the shoot and the root, around the cells.