Βιοτεχνολογική παραγωγή μεταβολικών προϊόντων προστιθέμενης αξίας κατά την αύξηση στελεχών της ζύμης Yarrowia lipolytica σε υποστρώματα με βάση τη γλυκερόλη

Abstract

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση της ικανότητας ανάπτυξης στελεχών της ζύμης Yarrowia lipolytica να αποικοδομήσει υποστρώματα που προέρχονται από ανανεώσιμες πρώτες ύλες. Ακριβέστερα, χρησιμοποιήθηκε ακάθαρτη βιομηχανική γλυκερόλη, καθαρότητας 88% κατά βάρος που ήταν παραπροϊόν της βιομηχανικής παραγωγής βιολογικού πετρελαίου (βιοντίζελ - biodiesel). Μελετήθηκε η ικανότητα των στελεχών να μεταβολίζουν το υπόστρωμα προς παραγωγή βιομάζας, δευτερογενών ενδοκυτταρικών μεταβολιτών, καθώς και εξωκυτταρικών μεταβολικών προϊόντων. Οι καλλιέργειες έλαβον χώραν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις υποστρώματος και χλωριούχου νατρίου σε σταθερές συνθήκες ανάδευσης και θερμοκρασίας για υψηλό και χαμηλό pH. Χρησιμοποιήθηκαν στελέχη ζυμών του γένους Yarrowia lipolytica ACA YC-5030 και NRRL Y-423.

Στην πειραματική διαδικασία πραγματοποιήθηκαν υγρές καλλιέργειες σε αναδευόμενες φιάλες Erlenmeyer (250mL), χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα γλυκερόλη, σε διαφορετικές συγκεντρώσεις, με ή χωρίς προσθήκη χλωριούχου νατρίου (29ºC, 180rpm). Έγινε προσδιορισμός της βιομάζας με ξήρανση και στη συνέχεια εκχύλιση των λιπιδίων για ποσοτικό προσδιορισμό τους. Επίσης, η παραγωγή ενδοπολυσακχαριτών προσδιορίστηκε με εκχύλιση μέσω υδρολύσεως τους και προσδιορισμό των αναγωγικών σακχάρων με τη μέθοδο DNS. Η παραγωγή πολυολών και η κατανάλωση των σακχάρων προσδιορίστηκε μέσω υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC).

Η παρούσα μελέτη χωρίστηκε σε δυο πειραματικά στάδια. Στο πρώτο στάδιο, τα δύο στελέχη εξετάστηκαν σε συνθήκες περιορισμού σε άζωτο σε υγρές καλλιέργειες με βιομηχανική γλυκερίνη ως υπόστρωμα, συγκέντρωσης 40 g L-1, 80 g L-1 και 120 g L-1 σε σταθερή θερμοκρασία 29ºC και τιμές pH 2 & 6. Αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητα τους να καταναλώνουν την γλυκερόλη και να την μετατρέπουν σε βιομάζα, ενδοπολυσακχαρίτες, μικροβιακά λιπίδια και πολυόλες. Διαπιστώθηκε από τις μετρήσεις ότι και τα δυο στελέχη προσαρμόστηκαν στο υπόστρωμα της γλυκερόλης, παράγοντας ικανοποιητικές ποσότητες προϊόντων. Το στέλεχος NRRL Y-423 παρατηρήθηκε ότι παρήγαγε μεγαλύτερες ποσότητες πολυολών. Ειδικότερα, σε συγκέντρωση 120 g L-1, το σύνολο των πολυολών έφτασε τα ~33 g L-1, με παραγωγή μαννιτόλης ~25 g L-1.

Στο δεύτερο στάδιο πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις με τα ίδια στελέχη, σε σταθερή συγκέντρωση γλυκερόλης 40 g L-1, στις ίδιες τιμές θερμοκρασίας και δυο διαφορετικές τιμές pH (2 και 6), με μόνη διαφορά την προσθήκη χλωριούχου νατρίου διαφόρων συγκεντρώσεων (10 g L-1, 30 g L-1, 50 g L-1 και 80 g L-1). Αυτή η προσθήκη οδήγησε στο συμπέρασμα πως η αυξανόμενη συγκέντρωση της προσθήκης NaCl έφερε σαν αποτέλεσμα την μεγαλύτερη παραγωγή ερυθριτόλης αντί μαννιτόλης για το στέλεχος ACA YC -5030.

The aim of this study was to investigate the ability of two strains of the yeast Yarrowia lipolytica to consume substrates deriving from renewable raw materials. More precisely, crude - industrial glycerol (purity 88% by weight) was used, which was a by-product of the industrial production of biofuel (biodiesel). The ability of strains to metabolize the substrate and to produce biomass, secondary intra-cellular metabolites, and extra-cellular metabolic products was studied. Cultures were carried out at different initial substrate and sodium chloride concentrations under constant stirring and temperature conditions for two incubation oH values, namely 2.0 and 6.0.

Yarrowia lipolytica strains ACA YC-5030 and NRRL Y-423 were used. In the experimental procedure, submerged cultures were carried out in shake flasks (250mL), using glycerol as a carbon source, at different concentrations, with or without the addition of sodium chloride (29ºC, 180rpm). Biomass was determined by drying and then extraction of lipids for their quantitative determination occurred. Also, the production of endopolysaccharides was determined by the biomass digestion and subsequent quantitative determination of the liberated reducing sugars with DNS method. The production of polyols and the consumption of glycerol were determined by high performance liquid chromatography (HPLC).

The present study was divided into two experimental stages. In the first stage, the two strains were examined in nitrogen-limited conditions in liquid cultures with industrial glycerol as substrate, at initial concentration 40 g L-1, 80 g L-1 & 120 g L-1 at a constant temperature of 29 ºC and initial pH values 2 & 6. Strains were evaluated for their ability to consume glycerol and convert it into biomass, endopolysaccharides, microbial lipids and polyols. Determinations showed that both strains adapted well to glycerol, producing sufficient amounts of metabolites. NRRL Y-423 strain was observed to produce larger amounts of polyols. In particular, at a concentration of glycerol at 120 g L-1, the total of the polyols reached ~33 g L-1, with a production of mannitol of ~25 g L-1.

In the second stage fermentations were performed with the same strains, at a constant concentration of glycerol 40 g L-1, at the same temperature and pH values (2 & 6), with the only difference being the addition of sodium chloride of different initial concentrations (10 g L-1, 30 g L-1, 50 g L-1 & 80 g L-1). This addition led to the conclusion that the increasing concentration of NaCl addition resulted in higher production of erythritol instead of sum of mannitol and arabitol.