Bioprocess development and transcriptomic analysis for succinic acid production via fermentation using waste streams from the pulp and paper industry

Abstract

The scope of this thesis is the evaluation of spent sulphite liquor (SSL) derived as by-product stream from the sulphite pulping process of Eucalyptus globulus wood for the production of succinic acid via microbial fermentations. The study was initiated with the analysis of the composition of SSL and the evaluation of the inhibitory effect of SSL components and metabolic products on succinic acid production and bacterial growth. The evaluation of acetic acid, furfural and methanol showed that concentrations of 12, 1 and 4 g/L, respectively, are inhibitory for Actinobacillus succinogenes growth, while concentrations of 12, 3 and 8 g/L, respectively, are inhibitory for Basfia succiniciproducens growth. Lignosulphonates also posed major inhibitory effect on succinic acid production at concentrations higher than 50 g/L. Based on the high lignosulphonate concentration of the thick SSL used in this study, it was concluded that pretreatment of SSL should be carried out before fermentation. The critical concentrations of succinic acid, lactic acid, formic acid and acetic acid that inhibit bacterial growth and succinic acid production were 55, 60, 18 and 38 g/L, respectively. Ultrafiltration and nanofiltration of SSL was employed in order to evaluate the sequential extraction of lignosulphonates and the production of bio-based succinic acid using the bacterial strains A. succinogenes and B. succiniciproducens. Furthermore, this pretreatment step produced a permeate liquid stream with low lignosulphonate content that led to efficient succinic acid production. Ultrafiltration with membranes of 10, 5 and 3 kDa molecular weight cut-off result in significant losses of lignosulphonates (26 - 50%) in the permeate stream, while nanofiltration using membrane with 500 Da molecular weight cut-off results in high retention yields of lignosulphonates (95.6%) in the retentate stream and 66% of total sugars in the permeate stream. Fed-batch bioreactor cultures using permeates from ultrafiltrated SSL resulted in similar succinic acid concentration (27.5 g/L) and productivity (0.4 g/L/h) by both strains. When permeates from nanofiltrated SSL were used, the strain B. succiniciproducens showed the highest succinic acid concentration (33.8 g/L), yield (0.58 g per g of consumed sugars) and productivity (0.48 g/L/h). Ultrafiltration of SSL resulted in higher succinic acid production per t of SSL used, whereas nanofiltration resulted in higher LS recovery per t of SSL used. The nanofiltration of 1 t of thick SSL could lead to the production of 306.3 kg of lignosulphonates and 52.7 kg of succinic acid when B. succiniciproducens is used or 51.8 kg of succinic acid when A. succinogenes is used. The ultrafiltration of 1 t of thick SSL using a 3 kDa membrane could result in the production of 237 kg of lignosulphonates and 71.8 kg of succinic acid when B. succiniciproducens is used. The metabolic potential of A. succinogenes was evaluated through RNA expression of the genes that encode the enzymes involved in succinic acid production when the bacterial strain was cultivated on glucose, xylose and SSL. Ultrafiltrated SSL was selected as the substrate to analyse RNA expression levels, which were compared with respective expression levels observed in glucose and xylose bioreactor cultures. Xylose and glucose were selected because they constitute 73% and 10% of the total sugars contained in SSL. A transcriptomic approach of the key enzymes of glucose and xylose catabolism, carboxylic acid production as well as oxidative phosphorylation led to an improved understanding on the energy consuming metabolic pathways. The transcriptomic analysis was carried out in batch cultures. A cDNA library was constructed at different phases of the fermentation where major metabolic changes in extracellular metabolites or biomass production were observed. RT-qPCR was used to determine the expression levels of the genes of interest throughout the fermentation. The bottlenecks of the fermentative production of succinic acid by A. succinogenes were addressed with particular focus on the effect of glucose and xylose catabolism on pathways that involve ATP consumption and NADH oxidation. All subunits of ATP synthase were highly expressed in SSL. In particular, ATP synthase F0 was higher expressed in SSL. Phosphoenol-pyruvate carboxykinase (PEPCK) expression was delayed when xylose was present in the medium. Despite the fact that extracellular lactic acid was not detected low expression levels of lactic acid dehydrogenase (LDH) were observed in all substrates. Finally, a breakthrough technology was applied in fed-batch B. succiniciproducens cultures that integrates succinic acid production via fermentation and in situ separation via electrochemical membrane extraction. The current drives the charged carboxylic acids across an anion exchange membrane by electromigration from the high-volume bioreactor into a low-volume extract that contains the succinic acid in higher concentrations. These membranes are permeable to many carboxylic acid anions (e.g. acetic acid, succinic acid), but impermeable to cells and solids, resulting in a combined extraction, clarification, acidification and concentration step in a single unit.

Ο σκοπός της διατριβής αυτής έγκειται στην αξιολόγηση του παράπλευρου ρεύματος που παράγεται από βιομηχανίες χαρτοπολτού (SSL) για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος μέσω μικροβιακών ζυμώσεων. Η μελέτη επικεντρώθηκε αρχικά στην ποσοτικοποίηση των κυριοτέρων συστατικών. Ακολούθως μελετήθηκε η παρεμπόδιση συγκεκριμένων συστατικών του SSL στην παραγωγή ηλεκτρικού οξέος και στην μικροβιακή ανάπτυξη. Οι συγκεντρώσεις του οξικού οξέος, της φουρφουράλης και της μεθανόλης που παρεμποδίζουν την ανάπτυξη του Actinobacillus succinogenes είναι 12, 1 and 4 g/L αντίστοιχα, ενώ οι αντίστοιχες συγκεντρώσεις για τον Basfia succiniciproducens είναι 12, 3 and 8 g/L, αντίστοιχα. Τα λιγνοσουλφονικά άλατα αποτελούν παρεμποδιστικά συστατικά σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από 50 g/L. Το γεγονός ότι το SSL που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη περιέχει υψηλή συγκέντρωση λιγνοσουλφονικών αλάτων οδήγησε στην απόφαση να προεπεξεργαστούμε το αρχικό SSL μέσω υπερδιήθησης ή νανοδιήθησης. Οι συγκεντρώσεις του ηλεκτρικού οξέος, του γαλακτικού οξέος, του μυρμηγκικού οξέος και του οξικού οξέος που παρεμποδίζουν την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος είναι 55, 60, 18 και 38 g/L τόσο για τον A. succinogenes όσο και για τον B. succiniciproducens. Η επεξεργασία του SSL μέσω υπερδιήθησης ή νανοδιήθησης αξιολογήθηκε προκειμένου να εκτιμήσουμε τη δυνατότητα διαχωρισμού λιγνοσουλφονικών αλάτων και σακχάρων τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ακολούθως για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος με χρήση των στελεχών A. succinogenes και B. succiniciproducens. Η χρήση υπερδιήθησης με μεμβράνες με μοριακό βάρος αποκοπής της τάξης των 10, 5 και 3 kDa είχε ως αποτέλεσμα την απώλεια σημαντικών ποσοτήτων λιγνοσουλφονικών αλάτων (26 - 50%) στο διήθημα. Η χρήση νανοδιήθησης με μεμβράνες με μοριακό βάρος αποκοπής της τάξης των 500 Da οδήγησε σε υψηλό βαθμό διαχωρισμού λιγνοσουλφονικών αλάτων (95.6%). Η πραγματοποίηση ζυμώσεων ημι-διαλείποντος έργου με χρήση διηθήματος από επεξεργασμένο SSL μέσω υπερδιήθησης οδήγησε στην παραγωγή 27.5 g/L ηλεκτρικού οξέος με παραγωγικότητα 0.4 g/L/h όταν χρησιμοποιήθηκαν και οι δύο μικροοργανισμοί. Η υψηλότερη συγκέντρωση ηλεκτρικού οξέος (33.8 g/L), παραγωγικότητα (0.48 g/L/h) και βαθμός μετατροπής σακχάρων σε ηλεκτρικό οξύ (0.58 g/g) επετεύχθησαν με το στέλεχος B. succiniciproducens όταν αναπτύχθηκε σε διήθημα που παρήχθη μέσω νανοδιήθησης του SSL. Η νανοδιήθηση 1 τόνου SSL δύναται να οδηγήσει στην παραγωγή 306.3 kg λιγνοσουλφονικών αλάτων και 52.7 kg ηλεκτρικού οξέος όταν χρησιμοποιηθεί ο μικροοργανισμός B. succiniciproducens. Η υπερδιήθηση 1 τόνου SSL με χρήση μεμβράνης με μοριακό βάρος αποκοπής της τάξης των 3 kDa δύναται να οδηγήσει στην παραγωγή 237 kg λιγνοσουλφονικών αλάτων και 71.8 kg ηλεκτρικού οξέος όταν χρησιμοποιηθεί ο μικροοργανισμός B. succiniproducens. Η δυναμική του μεταβολισμού του A. succinogenes αξιολογήθηκε μέσω της έφρασης του RNA των γονιδίων που είναι υπεύθυνα για τα ένζυμα που συμμετέχουν στην παραγωγή ηλεκτρικού οξέος, σε υποστρώματα που περιέχουν γλυκόζη, ξυλόζη και στο παραπροϊόν της βιομηχανίας χαρτοπολτού. Επιλέχθηκε η μέθοδος της υπερδιήθησης για την προεπεξεργασία του SSL που χρησιμοποιήθηκε σαν υπόστρωμα για την μελέτη της έκφρασης του RNA. Πραγματοποιήθηκε σύγκριση των αποτελεσμάτων από τη ζύμωση σε SSL με ζυμώσεις που πραγματοποιήθηκαν σε γλυκόζη ή ξυλόζη. Η ξυλόζη και η γλυκόζη επιλέχθηκαν διότι αποτελούν τα κύρια σάκχαρα που περιέχονται στο SSL με περιεκτικότητα 73% και 10%, αντίστοιχα. Η μεταγραφομική ανάλυση των σημαντικότερων ενζύμων που συμμετέχουν στον καταβολισμό της γλυκόζης και της ξυλόζης, στον κύκλο των τρικαρβοξυλικών οξέων και της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης, οδήγησαν στην καλύτερη κατανόηση των μεταβολικών διαδικασιών. Η μεταγραφομική ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε ζυμώσεις διαλείποντος έργου σε εργαστηριακό βιοαντιδραστήρα. Σε διαφορετικές φάσεις της ζύμωσης, όπου παρατηρήθηκαν αλλαγές στους εξωκυτταρικούς μεταβολίτες, κατασκευάστηκαν cDNA βιβλιοθήκες. Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων «στόχων», σε διαφορετικές χρονικές στιγμές κατά τη διάρκεια της ζύμωσης, αναλύθηκαν με τη χρήση της RT-qPCR. Τα καθοριστικά σημεία του μεταβολισμού του A. succinogenes αναγνωρίστηκαν. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσίασαν τα μεταβολικά μονοπάτια που συμμετέχουν στην κατανάλωση ATP και στην οξείδωση του NADH σε συνδυασμό με τον καταβολισμό της γλυκόζης και της ξυλόζης. Όλες οι υπομονάδες της ATP συνθάσης υπερεκφράστηκαν στο SSL. Συγκεκριμένα, η F0 περιοχή της ATP συνθάσης υπερεκφράστηκε στο SSL. H έκφραση της φωσφοενολοπυροσταφυλικής καρβοξυκινάσης (PEPCK) ήταν χαμηλότερη όταν το θρεπτικό μέσο περιείχε ξυλόζη. Παρά το γεγονός ότι δεν ανιχνεύθηκε εξωκυτταρικό γαλακτικό οξύ, ανιχνεύθηκε η έκφραση της γαλακτικής δεϋδρογονάσης (LDH) σε όλα τα υποστρώματα. Τέλος, μία καινοτόμος τεχνολογία εφαρμόσθηκε σε καλλιέργεις ημι-διαλείποντος έργου με τον B. succiniciproducens, η οποία συνδυάζει την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος μέσω ζύμωσης με ταυτόχρονο διαχωρισμό του ηλεκτρικού οξέος μέσω μίας ηλεκτροχημικής κυψέλης στην οποία χρησιμοποιείται μία ανιονική μεμβράνη. Το ηλεκτρικό ρεύμα οδηγεί τα καρβοξυλικά οξέα από το υγρό της ζύμωσης, διαμέσου της ανιονικής μεμβράνης, σε ένα μικρότερου όγκου διάλυμα το οποίο περιέχει υψηλή συγκέντρωση ηλεκτρικού οξέος. Οι μεμβράνες αυτές είναι διαπερατές σε πολλά καρβοξυλικά οξέα (π.χ. οξικό οξύ, ηλεκτρικό οξύ), αλλά δεν είναι διαπερατές από μικροβιακά κύτταρα και στερεά συστατικά. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα να επιτυγχάνεται διαχωρισμός του ηλεκτρικού οξέος από το υγρό της ζύμωσης σε συνδυασμένο με την ταυτόχρονη μετατροπή του άλατος των καρβοξυλικών οξέων στην όξινη μορφή γεγονός το οποίο οδηγεί στη μείωση των σταδίων καθαρισμού του ηλεκτρικού οξέος (π.χ. απομάκρυνση μικροβιακών κυττάρων και προσμίξεων που περιέχονται στο υγρό της ζύμωσης).