Γονίδια, ένζυμα και βιοτεχνολογικές προσεγγίσεις του δευτερογενούς μεταβολισμού της ολευρωπαΐνης της ελιάς

Abstract

Οι φυτικοί οργανισμοί είναι εξοπλισμένοι με μια πληθώρα δευτερογενών μεταβολιτών που τους καθιστούν ικανούς να αντιμετωπίζουν τις βιοτικές και αβιοτικές προκλήσεις. Στο φυτό της ελιάς Olea europaea L. απαντάται ένας ιδιαίτερος τύπος σεκοϊριδοειδών που ονομάζονται ολεοσίδια. Οι μεταβολίτες αυτοί πέρα από τον ρόλο τους στην άμυνα του φυτού φαίνεται να έχουν και φαρμακευτικό ενδιαφέρον. Στην παρούσα διπλωματική εργασία έγινε μια προσπάθεια να αποσαφηνιστούν οι ιδιότητες των ενζύμων που συμμετέχουν στο μονοπάτι βιοσύνθεσης και καταβολισμού των ολεοσιδίων. Αρχικά, εξετάστηκε μια χαρακτηρισμένη μεθυλεστεράση, η OeEAME2, η οποία είναι ικανή να μετατρέπει την άγλυκη μορφή της ολευρωπαΐνης σε ολεασίνη. Για το συγκεκριμένο ένζυμο, έπειτα από in silico ανάλυση, δεν υπήρχε ανιχνεύσιμο σήμα πυρηνικού εντοπισμού αλλά παρόλα αυτά είχε πυρηνοκυτταροπλασματική τοποθέτηση. Προκειμένου να διερευνηθεί ο τρόπος με τον οποίο το ένζυμο αυτό εισέρχεται στον πυρήνα κρίθηκε σκόπιμο να επανεξεταστεί η υποκυτταρική τοποθέτηση του ενζύμου αυτή την φορά όμως σε επιδερμικά κύτταρα N.benthamiana όπου έχουν αποσιωπηθεί τα δύο ομόλογα γονίδια των ιμπορτινών α, NbImpa1 and NbImpa2, με το σύστημα της ιικο επαγόμενης σίγησης (VIGS). Σε αποσιωπημένα και μη φυτά αγροεγχύθηκε μια χιμαιρική μεθυλεστεράση η οποία είχε συντηγμένο στο Ν-τελικό της άκρο, το γονίδιο YFP (ΥFP-OeEAME2). Τα κύτταρα αυτά παρατηρήθηκαν σε συνεστιακό μικροσκόπιο και το φθορίζον σήμα ποσοτικοποιήθηκε. Το φθορίζον πρότυπο φαίνεται να διαφοροποιείται μεταξύ του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος ανάμεσα σε φυτά τα οποία έχουν αποσιωπηθεί και ανάμεσα σε φυτά τα οποία δεν έχουν αποσιωπηθεί. Συγκεκριμένα, στα αποσιωπημένα φυτά η ένταση του σήματος φθορισμού από τον πυρήνα είναι ελαττωμένη κατά στατιστικά σημαντικό τρόπο και έτσι επιβεβαιώνεται ότι η OeEAME2 εισέρχεται στον πυρήνα ενεργητικά μέσω του συστήματος των ιμπορτινών α1/α2. Ακόμη, στην προσπάθεια διερεύνησης της τεταρτοταγούς δομής του ενζύμου, μέσω της τεχνικής της χρωματογραφίας μοριακής διήθησης βρέθηκε πως, το OeEAME2 ομοδιμερίζεται in planta. Στην συνέχεια, εξετάστηκαν για την υποκυτταρική τους τοποθέτηση τέσσερις γλυκοζυλοτρανσφεράσες, ισχυροί υποψήφιοι από το φυτό της ελιάς, πιθανώς υπεύθυνες για την κατάλυση του ενζυμικού βήματος της μετατροπής του 7-δεοξυλογανετικού οξέος σε 7-δεόξυλογανικό οξύ με την μεταφορά μιας γλυκοζυλομάδας. Τα ένζυμα UGT-172, UGT-173,UGT-506 και UGT-710 ύστερα από σύντηξη με ένα μόριο YFP στο αμινοτελικό τους άκρο και αγροέγχυση σε φυτά N.benthamiana φάνηκε να τοποθετούνται σε πυρήνα και σε κυτταρόπλασμα.

Plants produce an enormous number of complex molecules that fulfill important roles outside their central metabolism such as dealing with biotic and abiotic challenges. Olea europaea L. biosynthesize an uncommon type of secoiridoids, known as oleosides. This class of metabolites has gained interest not only for their role in plant defense but also because of their possible medicinal properties. In this work, we tried to elucidate the properties of certain enzymes that catalyze the biosynthesis and catabolism of oleosides. Firstly, we focused on an already characterized methylesterase, OeEAME2, which converts oleuropein aglycone to oleacein. After in silico analysis, we were not able to detect a nuclear localization signal for OeEAME2, although it is localised in the nucleus and cytoplasm of the plant cells. In order to shed light on the way that this enzyme enters the nucleus, we wanted to test again the subcellular localization of this enzyme, but this time in epidermal cells of N. benthamiana, in which we employed virus-induced gene silencing (VIGS) to knockdown the expression of the two importin-a homologs NbImpa1 and NbImpa2. Agroinfiltration was used in both silenced and normal plants for heterologous transient expression of the chimeric protein YFP-OeEAME2. Confocal microscopy observations revealed a difference in fluorescence pattern between silenced and non-silenced plants' nucleus and cytoplasm. The fluorescence intensity observed in the nucleus was significantly lower in plants where NbImpa1 and NbImpa2 silenced. As a result, we were able to confirm that OeEAME2 enters the nucleus energetically via the importin a1/a2 system. Furthermore, in order to decipher the quaternary structure of OeEAME2, we used gel filtration chromatography, which revealed that this enzyme homodimerizes in planta. Finally, we investigated the subcellular localization of four strong olive candidates which may be involved in the conversion of 7-deoxyloganic acid to 7-deoxyloganetic acid. After fusion with YFP at the N-terminal end, and Agroinfiltration of N. benthamiana epidermal cells, these glycosyltransferases, namely UGT-172, UGT-173, UGT-506, and UGT-710, exhibited a nucleocytosolic localization.