The swine industry accounts for approximately 35% of the global meat production. EU is the second biggest producer of pork meat after China and the largest exporter of pork products. European policies promote greener and more sustainable agriculture and food systems and are expected to reshape the legislation relevant to the pig sector, including animal health and welfare.
To meet the surging demand for animal products and reduce production costs, modern farming systems are focused on intensification and higher stocking density. However, increased stocking density can accelerate pathogen transmission. On top of that, vast globalized trade networks and insufficient surveillance programs further exacerbate disease outbreaks and the emergence of transboundary infectious agents. Among them, viral diseases can be devastating to the swine sector due to (i) their transmission dynamics, (ii) the lack of effective treatments, (iii) the limited vaccine availability and efficiency, and (iv) the absence of monitoring systems and the lack of coordinated preventive measures. Porcine Parvovirus 1 (PPV1), Porcine Circovirus type 2 (PCV-2), Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV), Swine Influenza A (SIV), African Swine Fever Virus (ASFV) and Classical Swine Fever Virus (CSFV) are among the most important viral diseases affecting swine due to their socioeconomic impact, wide expansion and/or severity.
The time from disease onset to laboratory confirmation of the etiologic agent may vary from days to up to a month. For this reason, advanced laboratory technologies and biosensors have been gradually integrated in Point Of Service (POS) diagnostic devices to provide timely diagnosis, optimize livestock biosecurity and tackle animal diseases. These diagnostics are defined as analytical devices and other tests capable of providing rapid diagnosis on-site without the need of core laboratories. The available POS applications for animal diseases could be classified in two broad categories, paper-based diagnostics and microfluidic devices.
The main objectives of this thesis were the development of the analytical protocol and the initial validation of a novel microfluidic Lab-on-Chip analyzer for the rapid and reliable detection of major swine viral pathogens at the POS setting. The state-of-the-art POS diagnostic system targeted the six swine viruses mentioned earlier. The system utilized microfluidics and Photonic Integrated Circuit (PIC) sensors for the label-free detection of viral antigens.
The device followed a modular approach to efficiently integrate its components into a single, portable diagnostic platform weighing around 45 kg, with a size of about 40×50×60 cm. The dimensions and weight provided refer to a fully functional and autonomous device that include communication hardware and software, fully functional display and operational controls and waste containers, and a sterilization and sanitation module with a UV-C unit. The new diagnostic device can be divided into three functional subsystems: 1) the mechanics/microfluidics subsystem consisting of (i) a fluid delivery syringe system, (ii) motors, (iii) a microfluidics channel, (iv) a waste tank, and (v) a Peltier element, 2) the optics subsystem consisting of (i) a tunable laser, (ii) optic fibers, (iii) a photodiode and (iv) the biosensors, namely the Photonic Integrated Circuits (PICs) on silicon nitride, and 3) the firmware subsystem consisting of (i) the microcontroller and its software, (ii) an arduino data logger, and (iii) an SD card. Features such as system operation, analysis progress, data collection/storage, and results were monitored via an Android application. The assay for the detection of the six viruses could be completed within 60 min. Minimal handling and training was required for the operation of the device. The device also allowed multiplexing.
The biosensors used in the novel device utilized 8 ring resonators with immobilized antibodies (MREs) on their surfaces for the capturing of the viral particles. The capture of viral antigens via the antibodies resulted in a localized change in the refractive index which extended beyond the sensor’s surface. This change in the refractive index modified the resonant wavelength of the ring resonators upon laser excitation, causing a signal shift that was detected by the photodiode and was associated with the presence of the targeted viral particles.
The analysis protocol of the novel POS device included five consecutive steps: i) the buffer step, ii) the sample step, iii) the washing step, iv) the regeneration step and v) the final washing step. Two main buffers, phosphate buffered saline (PBS) and 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES), supplemented with Bovine Serum Albumin (BSA), were selected for viral detection. Data analysis was performed using a case-specific algorithm which incorporated the LOWESS (Locally Weighted Scatterplot Smoothing) algorithm, and a novel software for PC, written in Python. The same shift calculation algorithm was also accessible through an Android application (in a tablet) and an online platform.
Reference and complex biological samples (oral fluids and sera), collected from swine farms, were used to validate the device. All samples were tested with conventional PCR assays to confirm their status (positive or negative) and positive samples (containing the targeted viruses) were quantified using SYBR Green-based real-time PCR assays.
To estimate the Limit of Detection (LOD) of the novel device, six serial 3-fold dilutions of the reference samples were used starting from 108 viral genome copies/mL for PPV1, PCV-2, PPRSV and CSF and from 107 viral genome copies/mL for SIV and ΑSF. Moreover, the LOD of ASF functionalized sensors in sera was tested using six serial 3-fold dilutions (range of 107 – 3.3 × 104 viral genome copies/mL). Receiver operating characteristic (ROC) curves were drawn. The area under the curve (AUC) along with its 95% confidence intervals (95% CI) for all the studied viruses were calculated. Sensitivity, specificity, accuracy and precision were also calculated. Additionally, the positive likelihood ratio (PLR), negative likelihood ratio (NLR), and diagnostic odds ratio (DOR) were computed for each virus to assess the performance of the device. Calibrators (samples) were classified into three categories, negatives, positives, and weakly positives. For the classification of device measurements to True Positives (TP), True Negatives (TN), False Positives (FP), and False Negatives (FN) and the subsequent calculation of the performance metrics, the optimal thresholds of the ROC curve analysis were used. Considering that each ring resonator functions independently, the validation of the POC device was conducted at the ring level.
The novel device achieved LOD values ranging from 3.3 × 104 viral genome copies/mL for ASF and SIV to 3.3 × 105 viral genome copies/mL for PCV-2, PRRSV and CSF. The LOD of PPV1 functionalized sensors was higher reaching approximately 106 viral genome copies/mL. In general, PIC performance was satisfactory at ring level. PPV1 and PCV-2 functionalized sensors showed sensitivity of 68.60% and 69.50%, specificity of 77.10% and 70.30%, accuracy of 73.30% and 69.95%, precision of 71.08% and 63.33%, PLR of 3.00 and 2.34, NLR of 0.41 and 0.43, DOR values of 7.38 and 5.39 and AUC values of 0.820 and 0.742, respectively. PPRSV functionalized sensors achieved a sensitivity of 83.50%, specificity of 77.80%, accuracy of 80.50%, precision of 77.60%, PLR of 3.76, NLR of 0.21, DOR of 17.66, and AUC values of 0.812. The respective values for SIV functionalized sensors were 81.80%, 82.20%, 82.00%, 84.90%, 4.60, 0.22, 20.81, and 0.816. ASF and CSF functionalized sensors showed sensitivity of 80.79% and 79.00%, specificity of 88.46% and 79.07%, accuracy of 81.92% and 79.04%, precision of 97.60% and 68.70%, PLR of 7.00 and 3.77, NLR of 0.22 and 0.27, DOR values of 32.25 and 14.21 and AUC values of 0.832 and 0.830, respectively. At first glance, PRRSV, SIV, ASF and CSF sensors seemed to outperform PPV1 and PCV-2 sensors in terms of sensitivity, specificity and likelihood ratios, however, the 95% CIs of the aforementioned metrics overlapped, indicating that the recorded differences were not statistically significant. PRRSV, SIV, ASF and CSF sensors showed statistically significant higher DOR values than PCV-2 sensors, whereas only PRRSV and ASF sensors had statistically significant higher DOR values than PPV1 sensors. DOR value differences between PPV1 and PCV-2 sensors, as well as between PRRSV, SIV, ASF and CSF, were not statistically significant.
In the present work, photonic, microfluidic, signal processing, data collection/analysis and communication technologies were integrated into a single, portable device for the detection of swine viral diseases in oral fluids and serum samples. This is the first attempt to exploit PICs for the detection of swine pathogens in the POS setting, paving the way for the development of the next generation of animal diagnostics. The integration of modern nanomaterials, microfabrication technologies, instrumentation designs and sensors into POS devices and tests present exciting opportunities for the non-intrusive, real-time monitoring of animal health, behavior, and physiology.
The first validation data showed the novel device is a promising tool with satisfactory performance that can potentially reduce the time and costs required for the diagnosis of swine viral diseases, and at the same time enable rapid and local decision making for the implementation of evidence-based disease control measures. The device failed to quantify the viral load in the tested samples. Future research will focus on reducing the current system limitations, increase multiplexing, implement large-scale field validation studies, and increase the Technology Readiness Level (TRL) of the device for successful commercialization. The development and the commercialization of advanced POS devices through the exploitation of recent technological breakthroughs is expected to overcome the current limitations of POS methodologies such as portability, complexity, sample pretreatment, multiplexing and insufficient validation, and finally realize the translation of cutting-edge laboratory techniques to accessible and user-friendly devices and tests that improve the biosecurity, resilience, and sustainability of animal farming.
Η σημασία της χοιροτροφίας τονίζεται από το γεγονός ότι το χοιρινό κρέας αγγίζει σχεδόν το 35% της παραγωγής κρέατος σε παγκόσμιο επίπεδο. Το 2020 η εκτροφή χοίρων ανήλθε σε 150 εκατομμύρια ζώα και απέδωσε 23.8 εκατομμύρια τόνους χοίρειου κρέατος, ποσότητα που αντιστοιχεί περίπου το μισό της συνολικής παραγωγής κρέατος στην Ευρωπαϊκή Ένωση (ΕΕ). Η ΕΕ είναι ο δεύτερος μεγαλύτερος παραγωγός κρέατος μετά την Κίνα, και ο κύριος εξαγωγέας χοιρινού παγκοσμίως. Η χοιροτροφία στην Ευρώπη υπόκειται σε αρκετά νομοθετικά πλαίσια συμπεριλαμβανομένης της Κοινής Αγροτικής Πολιτικής (ΚΑΠ), τα οποία ρυθμίζουν την προστασία του περιβάλλοντος, την ασφάλεια των τροφίμων και την δημόσια υγεία, την παράγωγή οργανικών προϊόντων καθώς και την υγεία και την ευζωία των ζώων. Η νέα ΚΑΠ σε συνδυασμό με την Ευρωπαϊκή Πράσινη Συμφωνία και την στρατηγική «Από το Αγρόκτημα στο Πιάτο», προάγει την φιλικότερη στο περιβάλλον και βιώσιμη παραγωγή τροφίμων, ενώ αναμένεται να αναδιαμορφώσει την ισχύουσα νομοθεσία για την παραγωγή χοίρειου κρέατος καθώς και για την υγεία και ευζωία των ζώων.
Για να ανταπεξέλθουν στην αυξανόμενη ζήτηση ζωικών προϊόντων και παράλληλα να μειώσουν το κόστος παραγωγής, τα σύγχρονα συστήματα εκτροφής εστιάζουν στην εντατικοποίηση, στις αυξημένες εισροές και στην μεγαλύτερη πυκνότητα εκτροφής. Παρόλα αυτά, η αύξηση της πυκνότητας εκτροφής μπορεί να επιταχύνει την μετάδοση παθογόνων, θέτοντας σε κίνδυνο την υγεία και την ευζωία των ζώων. Επιπροσθέτως, τα εκτενή, διεθνή εμπορικά δίκτυα και η ελλιπής επιδημιολογική επιτήρηση των λοιμωδών νοσημάτων των ζώων εντείνουν την έξαρση επιδημιών και την ανάδυση νέων παθογόνων. Ανάμεσα σε αυτά τα παθογόνα, τα ιογενή νοσήματα μπορεί να είναι καταστροφικά για την χοιροτροφία λόγω των κάτωθι αιτιών: i) της δυναμικής της μετάδοσης τους, ii) της έλλειψης αποτελεσματικών θεραπειών, iii) του περιορισμένου αριθμού διαθέσιμων εμβολίων και της ενίοτε μειωμένης αποτελεσματικότητάς τους και iv) των περιορισμένων συστημάτων επιδημιολογικής επιτήρησης καθώς και την έλλειψη συντονισμένων μέτρων για την επιτυχή διαχείρισή τους. Ο Παρβοϊός τύπου 1 (Porcine Parvovirus 1 – PPV1), ο Κυκλοϊός τύπου 2 (Porcine Circovirus type 2 - PCV-2), το Αναπαραγωγικό και Αναπνευστικό Σύνδρομο των Χοίρων (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus - PRRSV), η γρίπη των χοίρων τύπου Α (Swine Influenza A - SIV), η Αφρικανική Πανώλη των Χοίρων (African Swine Fever Virus - ASFV) και η Κλασσική Πανώλη των Χοίρων (Classical Swine Fever Virus - CSFV) είναι ανάμεσα στα σημαντικότερα ιογενή νοσήματα των χοίρων λόγω του κοινωνικοοικονομικού τους αντικτύπου, της εξάπλωσής τους και της δριμύτητάς τους.
Δεδομένου ότι ο χρόνος που απαιτείται από την έναρξη της νόσησης ως την εργαστηριακή επιβεβαίωση του αιτιολογικού παράγοντα μπορεί να κυμαίνεται μεταξύ ημερών ως και ενός μηνός, προηγμένες εργαστηριακές τεχνολογίες και βιοαισθητήρες ενσωματώνονται σταδιακά σε διαγνωστικές συσκευές πεδίου για την παροχή έγκαιρης διάγνωσης, την βελτιστοποίηση της βιοσφάλειας των ζώων και κατ’ επέκταση την αντιμετώπιση των ασθενειών των ζώων. Ως διαγνωστικές συσκευές πεδίου ορίζονται οι συσκευές ανάλυσης και οι δοκιμές που είναι ικανές να παράσχουν γρήγορα διάγνωση στο πεδίο χωρίς να απαιτείται άλλος εργαστηριακός εξοπλισμός. Οι διαθέσιμες συσκευές πεδίου για τις ασθένειες των ζώων μπορούν να καταταχτούν σε δύο ευρείς κατηγορίες, διαγνωστικές συσκευές βασιζόμενες στο διηθητικό χαρτί και διαγνωστικές συσκευές μικρορευστομηχανικών στοιχείων.
Οι διαγνωστικές συσκευές βασιζόμενες στο χαρτί εκμεταλλεύονται τις ιδιότητες της κυτταρίνης και της νιτροκυτταρίνης για την δημιουργία του σώματος στο οποίο λαμβάνει χώρα η ανίχνευση των μορίων-στόχων. Τα υλικά αυτά καθορίζουν το πορώδες, την επιφανειακή χημεία και τις οπτικές ιδιότητες των διαγνωστικών συσκευών βασιζόμενων στο χαρτί. Αυτές οι ιδιότητες είναι συνυφασμένες με τις επιδόσεις και την αποτελεσματικότητα αυτών των διαγνωστικών. Επί του παρόντος, μηχανισμοί όπως χημικές αντιδράσεις, ηλεκτροχημικές αντιδράσεις, χημειοφωταύγεια και ηλεκτροχημειοφωταύγεια συνδυάζονται με τεχνικές ανάλυσης εικόνας για την ανίχνευση των μορίων-στόχων στις διαγνωστικές συσκευές βασιζόμενες στο χαρτί. Αντισώματα, αντιγόνα, ολιγονουκλεοτίδια και απταμερή χρησιμοποιούνται κατά κόρον ως Στοιχεία Μοριακής Αναγνώρισης (Molecular Recognition Elements - MREs). Οι διαγνωστικές συσκευές βασιζόμενες στο χαρτί μπορούν να ταξινομηθούν περαιτέρω σε δοκιμαστικές ταινίες (dipstick and strip tests) και σε δοκιμές πλευρικής ροής (Lateral Flow Assays - LFAs). Χαρακτηριστικοί αντιπρόσωποι της πρώτης κατηγορίας είναι οι δοκιμαστικές ταινίες pH και αντιβιοτικών στο γάλα και της δεύτερης κατηγορίας το τεστ εγκυμοσύνης και η ταχεία δοκιμή αντιγόνου για Covid-19.
Από την άλλη, οι διαγνωστικές συσκευές μικρορευστομηχανικών στοιχείων εκμεταλλεύονται δίκτυα μικροδιαύλων για τον χειρισμό των ρευστών και την ανάλυσή τους σε επίπεδο μικρόλιτρου ή νανόλιτρου. Ο χειρισμός και η ανάλυση των μορίων-στόχων γίνεται σε ειδικά σχεδιασμένους μικρορευστομηχανικούς διαύλους και θαλάμους. Η ροή των ρευστών στις ολοκληρωμένες συσκευές μικρορευστομηχανικών στοιχείων πραγματοποιείται μέσω του τριχοειδούς φαινομένου ή μέσω αντλιών. Οι συγκεκριμένες συσκευές απαιτούν μικρότερο όγκο δειγμάτων και αντιδραστηρίων και είναι κατά γενικό κανόνα μικρότερες σε μέγεθος. Αυτά τα πλεονεκτήματα τις κάνουν ευκολότερες στην χρήση και μειώνουν το κόστος λειτουργίας τους σε σχέση με τις συμβατικές εργαστηριακές δοκιμές. Επίσης, οι ολοκληρωμένες συσκευές μικρορευστομηχανικών στοιχείων δεν απαιτούν εξειδικευμένο προσωπικό για την χρήση τους, μειώνουν την πιθανότητα ανθρώπινου λάθους και είναι ταχύτερες. Οι συγκεκριμένες συσκευές μπορούν να ταξινομηθούν σε μικροσυστήματα συνολικής ανάλυσης (micro total analysis systems - μTAS), γνωστά ως «εργαστήρια σε τσιπ» (“lab-on-a-chip” - LOC), και σε αναλυτικές συσκευές μικρορευστομηχανικών στοιχείων βασιζόμενες στο χαρτί.
Τα μικροσυστήματα συνολικής ανάλυσης είναι ικανά να εκτελέσουν πλήθος εργαστηριακών δοκιμών (Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης – PCR, ισοθερμική ενίσχυση μέσω βρόχου – LAMP, ενίσχυση κυλιόμενου κύκλου – RCA κτλ.) ενσωματώνοντας όλα τα απαραίτητα βήματα των αναλύσεων σε μια μοναδική πλατφόρμα. Ο πυρήνας αυτών των συσκευών είναι το τσιπ ανίχνευσης (βιοαισθητήρας) όπου η αναλυτική διαδικασία και η βιοαναγνώριση των μορίων-στόχων λαμβάνει χώρα. Τα τσιπ ανίχνευσης συνήθως κατασκευάζονται από γυαλί, χαλαζία, πυρίτιο ή πολυμερή υλικά. Τρεις κύριοι παράγοντες καθορίζουν την αποτελεσματικότητα των τσιπ ανίχνευσης, ο σχεδιασμός των μικρορευστομηχανικών στοιχείων, η μορφή και η κατασκευή του κύριου σώματος της συσκευής και η συνάφεια και η συγγένεια των Στοιχείων Μοριακής Αναγνώρισης προς τα μόρια-στόχους. Η επιλογή των κατάλληλων Στοιχείων Μοριακής Αναγνώρισης επηρεάζει σε μεγάλο βαθμό τις επιδόσεις αυτών των διαγνωστικών συσκευών. Η ανίχνευση των μορίων-στόχων τυπικά πραγματοποιείται με την χρήση οπτικών και ηλεκτροχημικών μεθόδων, αισθητήρων μαγνητικής αντίστασης (magneto-resistive sensors - GMR), μέτρησης ακουστικών κυμάτων, φασματοσκοπίας μάζας και πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού.
Οι αναλυτικές συσκευές μικρορευστομηχανικών στοιχείων βασιζόμενες στο χαρτί συνδυάζουν τα χαρακτηριστικά τόσο των μικροσυστημάτων συνολικής ανάλυσης όσο και των διαγνωστικών συσκευών βασιζόμενων στο χαρτί, χρησιμοποιώντας οικονομικά υλικά (χαρτί) και απλές διαδικασίες παραγωγής. Σε αντίθεση με τις απλές διαγνωστικές συσκευές βασιζόμενες στο χαρτί, οι χάρτινες συσκευές μικρορευστομηχανικών στοιχείων επιτρέπουν τον ακριβή χειρισμό μικρών ποσοτήτων ρευστών, διευκολύνοντας έτσι τη μετάφραση περίπλοκων δοκιμών σε διαγνωστικές συσκευές πεδίου. Η κίνηση των υγρών γίνεται μέσω τριχοειδών φαινομένων, οπότε δεν απαιτείται κάποια πηγή ενέργειας ή μηχανικές βαλβίδες και αντλίες. Παρόλα αυτά, απαιτείται η κατασκευή των μικρορευστομηχανικών διαύλων μέσω της δημιουργίας υδρόφοβων φραγμών (απόφραξη των πόρων του χαρτιού). Η δημιουργία των υδρόφοβων φραγμών είναι υψίστης σημασίας καθώς καθορίζει το μήκος και το πλάτος των μικρορευστομηχανικών διαύλων και κατ’ επέκταση τις ιδιότητες της διαγνωστικής συσκευής. Από τη σκοπιά των μηχανισμών ανίχνευσης των μορίων-στόχων, η συγκεκριμένη κατηγορία διαγνωστικών συσκευών είναι συμβατή με ποτενσιομετρικούς, φθοριομετρικούς και χρωματομετρικούς αισθητήρες, θερμιδομετρικές και ενζυματικές μεθόδους, μεθόδους χημειοφωταύγειας και ηλεκτροχημειοφωταύγειας, φθορίζοντα νανοσωματίδια κβαντικής κουκκίδας και μεταλλικά σύμπλοκα.
Ως βιοαισθητήρες ορίζονται οι αισθητήρες που χρησιμοποιούν βιολογικά μόρια ακινητοποιημένα στην επιφάνεια τους που είναι ικανά να αναγνωρίσουν μόρια-στόχους ενδεικτικά μικροοργανισμών ή παθολογικών καταστάσεων. Αυτά τα βιολογικά μόρια είναι γνωστά ως βιοϋποδοχείς. Ευρέως χρησιμοποιούμενοι βιοϋποδοχείς είναι τα αντισώματα, το RNA και το DNA, οι γλυκάνες, οι λεκτίνες, τα ένζυμα, διάφοροι συμπαράγοντες, ιστοί ή κύτταρα. Η βιοαναγνώριση μετατρέπεται σε μετρήσιμα σήματα μέσω ειδικών μετατροπέων που επιτρέπουν την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση των μορίων-στόχων. Οι βιοαισθητήρες, βάσει της μεθοδολογίας που γίνεται η μετατροπή της βιοαναγνώρισης σε μετρήσιμο σήμα, μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε οπτικούς, ηλεκτροχημικούς, πιεζοηλεκτρικούς, μαγνητικούς, θερμικούς, ραδιενεργούς, και μηχανικούς.
Οι κύριοι στόχοι της παρούσας διδακτορικής διατριβής περιλαμβάνουν την ανάπτυξη του πρωτοκόλλου ανάλυσης και την πιστοποίηση μίας νέας διαγνωστικής συσκευής πεδίου βασιζόμενης σε ένα μικροσύστημα συνολικής ανάλυσης (LOC) για την ταχεία διάγνωση ιογενών νοσημάτων των χοίρων. Η νέα διαγνωστική συσκευή στόχευε στην ανίχνευση των έξι προαναφερθέντων ιογενών νοσημάτων και ενσωματώνει μικρορευστομηχανικά στοιχεία και Φωτονικά Ολοκληρωμένα Κυκλώματα για την απευθείας ανίχνευση των ιικών αντιγόνων σε βιολογικά δείγματα.
Η διαγνωστική συσκευή είχε ενσωματωμένα όλα της τα δομικά στοιχεία σε μία φορητή πλατφόρμα, συνολικού βάρους 45 κιλών και μεγέθους 40×50×60 εκατοστών. Οι ανωτέρω διαστάσεις και το βάρος αφορούν την πλήρως αυτόνομη και λειτουργική διαγνωστική συσκευή συμπεριλαμβανομένων του μηχανολογικού εξοπλισμού, της δεξαμενής για τις απορροές μετά την ολοκλήρωση της ανάλυσης καθώς και τo σύστημα αποστείρωσης υπεριώδους (UV-C) ακτινοβολίας. Η νέα διαγνωστική συσκευή μπορεί να χωριστεί σε τρία κύρια υποσυστήματα: 1) το μηχανικό/μικρορευστομηχανικό υποσύστημα που αποτελούνταν από i) ένα σύστημα μεταφοράς υγρών με την χρήση συρίγγων, ii) κινητήρες, iii) μικρορευστομηχανικούς διαύλους, iv) δεξαμενή απόρριψης και v) μία συστοιχία Peltier, 2) το οπτικό υποσύστημα που αποτελούνταν από i) ένα ρυθμιζόμενο λέιζερ, ii) οπτικές ίνες, iii) φωτοδίοδο και iv) τους βιοαισθητήρες Φωτονικών Ολοκληρωμένων Κυκλωμάτων, και τέλος 3) το υλικολογισμικό υποσύστημα που αποτελούνταν από i) ένα μικροχειριστήριο και το λογισμικό του, ii) ένα καταγραφέα δεδομένων Arduino και iii) μια κάρτα μνήμης. Η λειτουργία του συστήματος, η πρόοδος της αναλυτικής διαδικασίας, η συλλογή και αποθήκευση των δεδομένων και η καταγραφή των αποτελεσμάτων ελέγχονταν μέσω μιας εφαρμογής Android. Η ανάλυση μπορούσε να ολοκληρωθεί εντός 60 λεπτών. Για τη χρήση της συσκευής δεν απαιτούνταν σημαντικοί χειρισμοί ούτε και η εκπαίδευση των τελικών χρηστών.
Τα φωτονικά ολοκληρωμένα κυκλώματα, οι βιοαισθητήρες της νέας συσκευής, χρησιμοποιούσαν 8 δακτυλίους με ακινητοποιημένα αντισώματα στην επιφάνειά τους για την σύλληψη των ιικών αντιγόνων από τα βιολογικά δείγματα. Ακολουθούμενης της διέγερσής τους υπό συνεχές μήκος κύματος διαμέσου του λέιζερ, κάθε δακτύλιος «δονούνταν» σε ένα μόνο συγκεκριμένο μήκος κύματος, παγιδεύοντας αυτό το μήκος κύματος του φωτός στο εσωτερικό του και παρεμποδίζοντάς το να φτάσει στην φωτοδίοδο. Ως αποτέλεσμα, δημιουργείτο μια μείωση της έντασης του φωτός στο συγκεκριμένο μήκος κύματος της «δόνησης» των δακτυλίων. Η σύλληψη των ιικών αντιγόνων στην επιφάνεια των δακτυλίων μέσω των αντισωμάτων οδηγούσε σε τοπική αλλαγή του συντελεστή διάθλασης του βιοαισθητήρα. Αυτή η αλλαγή του συντελεστή διάθλασης μεταφραζόταν σε αλλαγή της «συχνότητας δόνησης» των δακτυλίων και κατ’ επέκταση σε αλλαγή του μήκους κύματος που παγιδεύεται σε αυτούς. Έτσι, η μετατόπιση του σήματος (αλλαγή του παγιδευμένου μήκους κύματος) σχετίζεται άμεσα με τη σύλληψη των ιικών αντιγόνων από τα αντισώματα.
Η αναλυτική διαδικασία της νέας διαγνωστικής συσκευής πεδίου περιελάμβανε πέντε διαδοχικά βήματα: i) εισαγωγή ρυθμιστικού διαλύματος, ii) εισαγωγή του δείγματος, iii) έκπλυση, iv) αναγέννηση του βιαοσθητήρα και v) τελική έκπλυση. Δύο κύρια ρυθμιστικά διαλύματα, φυσιολογικός ορός στον οποίο έχει προστεθεί ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ιόντων (PBS) και ρυθμιστικό διάλυμα 2-(Ν-μορφολινο)εθανοθειικού οξέος (MES), συμπληρώθηκαν με βόεια λευκωματίνη ορού και χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των ιικών αντιγόνων. Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ειδικά διαμορφωμένου αλγορίθμου που περιλάβανε τον αλγόριθμο LOWESS, και νέου λογισμικού για υπολογιστές σε γλώσσα προγραμματισμού Python. Ο ίδιος αλγόριθμος για την ανάλυση των δεδομένων ήταν προσβάσιμος από τον τελικό χρήστη μέσω μιας εφαρμογής Android και μιας διαδικτυακής πλατφόρμας.
Πρότυπα δείγματα αναφοράς για τους έξι ιούς και σύνθετα βιολογικά δείγματα (σίελος και οροί αίματος), συλλεγμένα από χοιροτροφικές εκμεταλλεύσεις, χρησιμοποιήθηκαν για την πιστοποίηση της συσκευής. Όλα τα δείγματα δοκιμάστηκαν με συμβατική PCR για την επιβεβαίωση της απουσίας ή παρουσίας των ιικών σωμάτιων. Επιπροσθέτως, τα θετικά δείγματα ποσοτικοποιήθηκαν με τη χρήση PCR πραγματικού χρόνου βασιζόμενης στην μοριακή χρωστική SYBR Green.
Για τον υπολογισμό του ορίου ανίχνευσης της νέας συσκευής, χρησιμοποιήθηκαν έξι διαδοχικές αραιώσεις των πρότυπων δειγμάτων σε σίελο σε συγκεντρώσεις που άρχιζαν από 108 ιικά αντίγραφα/mL για τους ιούς PPV1, PCV-2, PPRSV και CSF και από 107 ιικά αντίγραφα/mL για τους ιούς SIV και ΑSF. Επιπροσθέτως, το όριο ανίχνευσης του ιού ASF μελετήθηκε και σε δείγματα ορού αίματος χρησιμοποιώντας πάλι έξι διαδοχικές αραιώσεις στο εύρος 107 – 3.3 × 104 ιικών αντιγράφων/mL. Επίσης έγινε ανάλυση των χαρακτηριστικών καμπυλών λειτουργίας δέκτη (receiver operating characteristic curves - ROC), εκτίμηση των περιοχών κάτω από την καμπύλη (Area Under the Curve - AUC) και υπολογισμός των 95% διαστημάτων εμπιστοσύνης (95% confidence intervals - 95% CI) για καθένα από τους ιούς. Ακόμη υπολογίστηκαν για κάθε νόσημα η ευαισθησία, η ειδικότητα, η ακρίβεια (accuracy), η πιστότητα (precision), ο θετικός λόγος πιθανοφάνειας (positive likelihood ratio - PLR), ο αρνητικός λόγος πιθανοφάνειας (negative likelihood ratio - NLR) και ο διαγνωστικός σχετικός λόγος συμπληρωματικών πιθανοτήτων (diagnostic odds ratio - DOR) με σκοπό την αξιολόγηση της διαγνωστικής συσκευής, χρησιμοποιώντας αρνητικά, θετικά και ασθενώς θετικά δείγματα. Για τον υπολογισμό των ανωτέρω μέτρων της διαγνωστικής επίδοσης της νέας συσκευής, τα αποτελέσματα κατηγοριοποιήθηκαν σε αληθώς θετικά (True Positives - TP), αληθώς αρνητικά (True Negatives - TN), ψευδώς θετικά (False Positives - FP), και ψευδώς αρνητικά (False Negatives - FN) με βάση τα βέλτιστα κατώφλια σήματος που ταυτοποιήθηκαν με τις καμπύλες ROC. Ο υπολογισμός των μέτρων και η πιστοποίηση της συσκευής έγινε σε επίπεδο δακτυλίου των αισθητήρων, καθώς κάθε δακτύλιος λειτουργεί ανεξάρτητα.
Οι τιμές των ορίων ανίχνευσης της νέας συσκευής κυμαίνονταν από 3.3 × 104 ιικά αντίγραφα/mL για τους ιούς ASF και SIV ως 3.3 × 105 ιικά αντίγραφα/mL για τους ιούς PCV-2, PRRSV και CSF. Το όριο ανίχνευσης για τον ιό PPV1 ήταν υψηλότερο, περίπου 106 ιικά αντίγραφα/mL. Σε γενικές γραμμές η επίδοση της νέας συσκευής και των βιοαισθητήρων σε επίπεδο δακτυλίου ήταν ικανοποιητική. Για τους ιούς PPV1 και PCV-2, η συσκευή εμφάνισε αντιστοίχως ευαισθησία 68.60% και 69.50%, ειδικότητα 77.10% και 70.30%, ακρίβεια 73.30% και 69.95%, πιστότητα 71.08% και 63.33%, PLR 3.00 και 2.34, NLR 0.41 και 0.43, DOR 7.38 και 5.39 και τιμές AUC 0.820 και 0.742. Για τον ιό PPRSV η συσκευή έδειξε ευαισθησία 83.50%, ειδικότητα 77.80%, ακρίβεια 80.50%, πιστότητα 77.60%, PLR 3.76, NLR 0.21, DOR 17.66, και τιμές AUC 0.812. Οι αντίστοιχες τιμές για τον ιό SIV ήταν 81.80%, 82.20%, 82.00%, 84.90%, 4.60, 0.22, 20.81, and 0.816. Ακόμη για του ιούς ASF και CSF (κατ’ αντιστοιχία) η συσκευή εμφάνισε τιμές ευαισθησίας, 80.79% και 79.00%, ειδικότητας 88.46% και 79.07%, ακρίβειας 81.92% και 79.04%, πιστότητας 97.60% και 68.70%, PLR 7.00 και 3.77, NLR 0.22 και 0.27, DOR 32.25 και 14.21 και AUC 0.832 και 0.830. Εκ πρώτης όψεως, φαίνεται ότι η συσκευή είχε καλύτερες επιδόσεις για του ιούς PRRSV, SIV, ASF και CSF σε σχέση με τις επιδόσεις των ιών PPV1 και PCV-2 τόσο για την ευαισθησία και την ειδικότητα όσο και τους λόγους πιθανοφάνειας. Παρόλα αυτά, τα 95% διαστήματα εμπιστοσύνης αλληλοκαλύπτονταν, αποδεικνύοντας ότι οι διαφορές στις επιδόσεις δεν ήταν στατιστικά σημαντικές. Η συσκευή είχε στατιστικώς σημαντικά μεγαλύτερες επιδόσεις όσον αφορά τον διαγνωστικό σχετικό λόγο συμπληρωματικών πιθανοτήτων DOR για τους ιούς PRRSV, SIV, ASF και CSF σε σχέση με τον ιό PCV-2, ενώ σε σχέση με τον ιό PPV1 η διαφορά παρέμενε στατιστικώς σημαντική μόνο για τους ιούς PRRSV και ASF. Οι διαφορές των τιμών DOR αναμεταξύ των ιών PRRSV, SIV, ASF και CSF και αναμεταξύ των ιών PPV1 και PCV-2 δεν ήταν στατιστικώς σημαντική.
Στην παρούσα εργασία, φωτονικά ολοκληρωμένα κυκλώματα, μικρορευστομηχανικά στοιχεία και τεχνολογίες τηλεπικοινωνιών και πληροφορικής ενσωματώθηκαν σε μία φορητή συσκευή για την ανίχνευση ιογενών νοσημάτων των χοίρων σε δείγματα σιέλου και ορού αίματος. Μάλιστα, η παρούσα αποτελεί την πρώτη προσπάθεια χρήσης φωτονικών ολοκληρωμένων κυκλωμάτων για την ανίχνευση ιικών παθογόνων στο πεδίο, ανοίγοντας τον δρόμο για την ανάπτυξη διαγνωστικών συσκευών πεδίου νέας γενιάς στην ζωική παραγωγή. Η ανάπτυξη νανοϋλικών και τεχνολογιών μικροκατασκευής, ο συνδυασμός τους με καινοτόμα όργανα και αισθητήρες και η ενσωμάτωσή τους σε διαγνωστικές συσκευές πεδίου παρουσιάζουν νέες δυνατότητες για την μη παρεμβατική παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο της υγείας των ζώων, της συμπεριφοράς και της φυσιολογίας τους.
Τα πρώτα πειραματικά δεδομένα για την πιστοποίηση της νέας διαγνωστικής συσκευής πεδίου υποδεικνύουν ότι η συσκευή έχει ικανοποιητικές επιδόσεις, μπορεί να μειώσει τον χρόνο και το κόστος που απαιτείται για την διάγνωση των ιογενών νοσημάτων των χοίρων και παράλληλα μπορεί να επιτρέψει την ταχεία λήψη αποφάσεων σε τοπικό επίπεδο για την εφαρμογή μέτρων ελέγχου των νοσημάτων με βάση επιστημονικά δεδομένα. Παρόλο που η συσκευή είναι ένα πολλά υποσχόμενο εργαλείο, δεν μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την ποσοτικοποίηση των δειγμάτων. Μελλοντικές έρευνες θα πρέπει να επικεντρωθούν στην επίλυση των προβλημάτων και των περιορισμών του παρόντος συστήματος, στην αύξηση των ασθενειών-στόχων, στην εκτέλεση περισσότερων δοκιμών πιστοποίησης σε πραγματικές συνθήκες πεδίου και στην αύξηση του επιπέδου τεχνολογικής ετοιμότητας (Technology Readiness Level - TRL) της συσκευής για την επιτυχή εμπορική της εκμετάλλευση. Η ανάπτυξη και η εμπορική εκμετάλλευση προηγμένων διαγνωστικών συσκευών πεδίου μέσω της αξιοποίησης νέων τεχνολογικών επιτευγμάτων αναμένεται να υπερσκελίσει τις προκλήσεις που αντιμετωπίζουν αυτές οι συσκευές όπως η περιορισμένη φορητότητα, η πολυπλοκότητα, η ανάγκη επεξεργασίας των δειγμάτων, ο περιορισμένος αριθμός των μορίων-στόχων για κάθε δοκιμή και η ανεπαρκής πιστοποίησή τους. Τέλος, η αξιοποίηση των νέων τεχνολογικών επιτευγμάτων αναμένεται να μεταφράσει διάφορες καινοτόμες εργαστηριακές τεχνικές σε προσβάσιμες και φιλικές προς τον τελικό χρήστη διαγνωστικές συσκευές πεδίου που θα ενισχύσουν την βιοασφάλεια, την ανθεκτικότητα και την βιωσιμότητα της Ζωικής Παραγωγής.
