Μελέτη του μεταβολισμού μορφοτύπων του παθογόνου αιτίου του γλοιοσπορίου της ελιάς (Colletotrichum acutatum), για την ανακάλυψη νέων στόχων για φυτοπροστατευτικά προϊόντα με εφαρμογή μεταβολομικής και in vitro αξιολόγηση εναλλακτικών προϊόντων φυτοπροστασίας

Abstract

Η ελιά αποτελεί το σημαντικότερο παραγωγικό δέντρο στη ζώνη της Μεσογείου. Ένα πλήθος εχθρών και ασθενειών μαστίζουν την καλλιέργεια, με το γλοιοσπόριο να αποτελεί, πιθανώς, τη σημαντικότερη ασθένεια του ελαιόκαρπου, το κύριο παθογόνο αίτιο της οποίας είναι ο μύκητας Colletotrichum acutatum. Τα τελευταία χρόνια η ομάδα μας (Pesticide Metabolomics Group) έχει απομονώσει και ταυτοποιήσει διάφορα στελέχη του μύκητα τα οποία κατατάσσονται σε διαφορετικούς μορφότυπους, ενώ παρουσιάζουν κυμαινόμενα επίπεδα παθογένειας αλλά και ευαισθησίας-ανθεκτικότητας σε επιλεγμένες δραστικές ουσίες των ομάδων Στρομπιλουρινών και Τριαζολικών. Σε συνέχεια των εργασιών αυτών, στην παρούσα διπλωματική, μελετήσαμε δέκα στελέχη του μύκητα Colletotrichum acutatum για χαρακτηριστικά όπως η παθογένεια σε καρπούς δύο ποικιλιών ελιάς και η ευαισθησία σε τρία φυτοπροστατευτικά σκευάσματα. Ταυτόχρονα, στοχεύσαμε στην αναγνώριση και αποκωδικοποίηση των ομοιοτήτων και ιδιαιτεροτήτων μεταξύ των διαφορετικών στελεχών μέσω της μεταβολομικής ανάλυσης, για την αναγνώριση νέων στόχων για φυτοπροστατευτικά προϊόντα. Η παρούσα μελέτη κατέδειξε ιδιαιτερότητες στην ένταση της παθογόνου ικανότητας, στην ευαισθησία σε επιλεγμένα φυτοπροστατευτικά σκευάσματα, καθώς επίσης και στον μεταβολισμό των δέκα επιλεγμένων στελεχών ομαδοποιώντας τα σε δύο διακριτές ομάδες. Τα στελέχη της δεύτερης ομάδας παρουσίασαν, κατά πλειοψηφία, την τυπική για την ασθένεια συμπτωματολογία, με εξαίρεση τους άγουρους καρπούς των δυο ποικιλιών χωρίς πληγή. Εν αντιθέσει, τα στελέχη της πρώτης ομάδας κατάφεραν να μολύνουν και να αναπτύξουν τα τυπικά συμπτώματα μόνο στην περίπτωση των ώριμων καρπών της ποικιλίας Κορωνέικη, στους οποίους είχε προηγηθεί η πραγματοποίηση πληγής. Τα τρία σκευάσματα που εφαρμοστήκαν, παρουσίασαν κυμαινόμενη τοξικότητα στα τρία επιλεγμένα στελέχη. Πιο συγκεκριμένα, το σκεύασμα τερπενίων MEVALONE CS παρουσίασε πλήρη παρεμπόδιση της μηκυλιακής ανάπτυξης και των τριών στελεχών στις δόσεις εφαρμογής. Το στέλεχος PLS 93 ήταν το πιο ευαίσθητο έναντι και των δύο άλλων σκευασμάτων Biorend και LBG με δραστικές χιτοζάνη και φωσφονικό κάλιο αντίστοιχα. Ενδιαφέρον παρουσίασε το στέλεχος PLS 88, του οποίου η ανάπτυξη προωθήθηκε και στις τρείς συγκεντρώσεις του σκευάσματος LBG. Η μεταβολομική ανάλυση επιβεβαίωσε τις παρατηρηθείσες διαφοροποιήσεις, ομαδοποιώντας τα δέκα στελέχη σε δύο ομάδες. Ένα σύνολο μεταβολιτών βιοσημαντών αναγνωρίστηκαν, με στατιστικά σημαντικές διαφορές στη σχετική περιεκτικότητα του ενδομεταβολόματος μεταξύ των στελεχών των δύο ομάδων. Τόσο οι μεμονωμένοι, μεταβολίτες όσο και το σύνολο του μεταβολικού προφίλ αυτών των στελεχών θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την ταξινόμηση τυχαίων στελεχών αγρού, με βάση την ένταση της παθογόνου ικανότητας αλλά και της ευαισθησίας-ανθεκτικότητας σε δραστικές ουσίες και φυτοπροστατευτικά σκευάσματα. Τέλος, η αντίστροφη γενωμική ανάλυση, με βάση τους μεταβολίτες και τις μεταβολικές οδούς που φάνηκαν να έχουν θετική συσχέτιση με την ένταση της παθογένειας, κατέδειξε τα δύο ένζυμα Αμινοτρανσφεράση του 4-αμινοβουτιρικού-πυρουβικού, (4-Aminobutyrate-pyruvate transaminase, GABA-T) και Αμινοτρανσφεράση των αμινοξέων διακλαδισμένης αλυσίδας (Branched-chain-amino-acid transaminase, BCAT), ως πιθανούς στόχους για νέου τύπου φυτοπροστατευτικά σκευάσματα.

The olive tree is among the most important cultivated species in the Mediterranean basin. However, a multitude of enemies and diseases negatively affect the crop, with anthracnose being the most important disease of the olive fruit, the main pathogen of which is the fungus Colletotrichum acutatum. Recently, our research group (Pesticide Metabolomics Group) has isolated and identified various strains of the fungus that were classified into different morphotypes, each exhibiting variable pathogenicity and sensitivity to selected active ingredients of the Strobilurins and Triazoles groups. As a continuation of this work, here, we have studied ten Colletotrichum acutatum strains focusing on features such as their pathogenicity to fruits of two olive tree varieties and sensitivity to three plant protection preparations. At the same time, we aimed to identify and decode the similarities and specificities among the different strains through metabolomic analysis, in order to discover new targets for plant protection products (PPPs). Results revealed the differences of the pathogenicity, sensitivity to selected plant protection preparations, as well as of the metabolism among the strains being studied, grouping them into two distinct groups. Most of the strains of the second group caused the typical symptoms of the disease, with the exception of the unripe fruits of the two varieties without a wound. In contrast, the strains of the first group infected the fruits resulting into the development of the typical symptoms only in the case of ripe and wounded fruits of the variety Koroneiki. The three plant protection products applied exhibited variable toxicity to the three selected strains. More specifically, the fungicide MEVALONE CS completely inhibited the mycelial growth of all the strains at the applied doses. The strain PLS 93 was the most sensitive against both the Biorend and LBG products, containing chitosan and potassium phosphonate, respectively. Interestingly, the growth of the strain PLS 88 was promoted at all three concentrations of the LBG fungicide. Metabolomics confirmed the phenotypic differences, grouping the ten strains into two groups. A set of metabolites-biomarkers was identified, and statistically significant differences were detected among the relative content of the endometabolomes of the strains of the two groups. Both the individual metabolites and the recorded metabolite profiles of these strains could be used to classify random field strains, based on their pathogenicity but also on the sensitivity to active ingredients and PPPs. Finally, following a reverse genetics approach, metabolites and metabolic pathways with a strong positive correlation with pathogenicity, we have discovered two enzymes, the 4-Aminobutyrate-pyruvate transaminase (GABA-T) and the Branched-chain-amino-acid transaminase (BCAT), as novel potential targets for alternative PPPs.