Διερεύνηση του προφίλ έκφρασης του γονιδίου της κινάσης της ριβοφλαβίνης / φωσφατάσης του FMN στο Arabidopsis thaliana

Abstract

Η ριβοφλαβίνη ή αλλιώς όπως ονομάζεται βιταμίνη B2 αποτελεί μία εκ των συνολικά 8 υδατοδιαλυτών, ουσιών που ανήκουν στην ομάδα των βιταμινών του συμπλέγματος Β. Η απομόνωση και η αποσαφήνιση της δομής της κορυφώθηκε με την απονομή του βραβείου Νόμπελ χημείας στους Paul Karrer και Richard Kuhn το 1937 και 1938. Η βιομηχανική της σημασία είναι μεγάλη με την παραγωγή της αρχικά με χημικές μεθόδους και έπειτα με βιοτεχνολογικές μεθόδους με τη χρήση βακτηριακών στελεχών, οι οποίες και επικράτησαν. Η παγκόσμια αγορά παραγωγής ριβοφλαβίνης για ανθρώπινη και ζωική χρήση έχει υπερδιπλασιαστεί πλέον και ξεπερνά τους 9000 τόνους το χρόνο. Η ριβοφλαβίνη έχει ήδη αποτελέσει αντικείμενο πολυετών ερευνών, οι οποίες έχουν οδηγήσει στη χαρτογράφηση του βιοσυνθετικού της μονοπατιού σε βακτήρια και μύκητες. Ωστόσο, παρότι το αντίστοιχο μονοπάτι στα φυτά παρουσιάζει ομοιότητες με εκείνο των βακτηρίων, δεν έχουν ξεκαθαριστεί πλήρως όλα τα ένζυμα που συμμετέχουν αλλά και οι αλληλεπιδράσεις τους με άλλες πρωτεΐνες. Το γονίδιο At4g21470 κωδικοποιεί ένα διλειτουργικό ένζυμο στο μονοπάτι της ριβοφλαβίνης, της κινάσης ριβοφλαβίνης/φωσφατάσης FMN, και έχει εμφανίσει συσχέτιση με την αντίδραση στο οξειδωτικό στρες. Στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας, προσπαθήσαμε να εξετάσουμε το πρότυπο έκφρασης αυτού του γονιδιακού τόπου και να διαφυλάξουμε την υποκυτταρική και ιστοειδική του θέση. Για αυτόν τον σκοπό, εισαγάγαμε την επιθυμητή γενετική κατασκευή σε φυτά Arabidopsis thaliana μέσω μιας σειράς μοριακών κλωνοποιήσεων. Ταυτόχρονα, εξέτασαμε τον υποκινητή του γονιδίου, όπου η αναζήτηση σε βιολογικές βάσεις δεδομένων ανέδειξε περίπου 50 διαφορετικά σημεία σύνδεσης για αυτόν τον συγκεκριμένο υποκινητή. Παρ' όλα αυτά, είναι αναγκαία η περαιτέρω μελέτη του προτύπου έκφρασής του σε διάφορους ιστούς και αναπτυξιακά στάδια, όπου η γύρη αναπτύσσεται. Επιπλέον, μια ανάλυση της αλληλεπίδρασης του υποκινητή αυτού του γονιδίου με άλλες πρωτεΐνες σύνδεσης προς αυτόν μπορεί να εξεταστεί μέσω του συστήματος δύο υβριδίων στις ζύμες, με σκοπό να διερευνήσουμε περαιτέρω τον ρόλο του υποκινητή στον έλεγχο της έκφρασης του γονιδίου.

Riboflavin, or vitamin B2 as it is called, is one of a total of 8 water-soluble substances that belong to the group of vitamins of the B complex. The isolation and elucidation of its structure culminated in awarding the Nobel Prize in Chemistry to Paul Karrer and Richard Kuhn in 1937 and 1938. Its industrial importance is great with its production initially by chemical methods and then by biotechnological methods using bacterial strains, which prevailed. The global market for riboflavin production for human and animal use has now more than doubled to over 9000 tons per year. Riboflavin has already been the subject of many years of research, which has led to the mapmapping synthetic pathway in bacteria and fungi. However, although the corresponding pathway in plants shows similarities with that of bacteria, not all the enzymes involved and their interactions with other proteins have been fully elucidated. The At4g21470 gene encodes a bifunctional enzyme in the riboflavin pathway, riboflavin kinase/FMN phosphatase, and has been shown to be associated with oxidative stress response. In the context of the present work, we attempted to examine this gene locus’s expression pattern and preserve its subcellular and tissue-specific location. To this end, we introduced the desired genetic construct into Arabidopsis thaliana plants through a series of molecular cloning. At the same time, we examined the gene's promoter, where a search of biological databases revealed approximately 50 different binding sites for this promoter. Nevertheless, further study of its expression pattern in various tissues and developmental stages, where the pollen develops, is necessary. In addition, an analysis of the interaction of the promoter of this gene with other proteins binding to it can be examined through the yeast two-hybrid system, to further investigate the role of the promoter in the control of gene expression.