Στη σημερινή εποχή η βιοτεχνολογία μικροφυκών έχει προσελκύσει το ενδιαφέρον της επιστημονικής και βιομηχανικής κοινότητας ως πρωτογενής βιολογικός πόρος για την παραγωγή ενός μεγάλου εύρους προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας (αντιοξειδωτικά, πρωτεΐνες, λιπαρά οξέα, βιταμίνες, φυσικές χρωστικές κλπ.), τα οποία βρίσκουν ευρεία εφαρμογή στη βιομηχανία τροφίμων, ενέργειας, υγείας κλπ.. Τα μικροφύκη θεωρούνται ένας σημαντικός πυλώνας της κυκλικής βιοοικονομίας γιατί θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν στο πλαίσιο της διαχείρισης οργανικών αποβλήτων για τη παραγωγή βιομάζας υψηλής οικονομικής αξίας. Τυπικά, είναι φωτοσυνθετικοί μικροοργανισμοί αλλά μπορούν παράλληλα να αναπτυχθούν αξιοποιώντας οργανικό άνθρακα όπως, σάκχαρα, γλυκερόλη, οξικό οξύ κλπ. Παρόλο που στην πλειονότητα τους είναι αυτότροφοι μικροοργανισμοί, βιομηχανικά μπορούν αξιοποιηθούν σε ετερότροφα και μικτότροφα συστήματα καλλιεργειών.
Η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει ως κύριο αντικείμενο την αξιοποίηση βιομηχανικής γλυκερόλης (παραπροϊόν βιοντίζελ) και τη βιομετατροπή της σε προϊόντα υψηλής προστιθέμενης αξίας μέσω βιοδιυλιστηρίου μικροφυκών. Η αξιοποίηση της ακατέργαστης γλυκερόλης έγινε μέσω βιοδοκιμών με τις οποίες αξιολογήθηκαν διάφορα είδη μικροφυκών γλυκού νερού: Chlorella vulgaris, Auxenochlorella protothecoides, Scenedesmus obliquus, Scenedesmus quadricauda καθώς και ένα θαλάσσιο μικροφύκος το Tetraselmis chuii. Όλες οι πειραματικές δοκιμές είχαν ως στόχο τη διερεύνηση της δυναμικότητας του κάθε είδους μικροφύκους σε περιβάλλοντα ανάπτυξης με κύρια πηγή άνθρακα την ακατέργαστη γλυκερόλη σε διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις. Επιπλέον, το βιοχημικό προφίλ των μικροφυκών (περιεκτικότητα σε πρωτογενείς και δευτερογενείς μεταβολίτες) επηρεάζεται από τις καλλιεργητικές παραμέτρους που επιλέγονται κάθε φορά και μπορεί συνεπώς να επιτευχθεί αύξηση της συγκέντρωσης ορισμένων μεταβολιτών στόχων (πρωτεΐνες, υδατάνθρακες, λιπίδια και χρωστικές) μεταβάλλοντας την ένταση και την ποιότητα (μήκος κύματος) του φωτός που παρέχεται στην καλλιέργεια ή με την απουσία συγκεκριμένων θρεπτικών στοιχείων (π.χ. το άζωτο) από το υπόστρωμα.
Η παρούσα μελέτη εστίασε στη διερεύνηση αξιοποίησης των παραπάνω μικροφυκών τόσο μέσω ετερότροφων, όσο και μικτότροφων συστημάτων καλλιέργειας, με δοκιμές σε διαλείποντος έργου και ημιδιαλείποντος έργου συστήματα καλλιέργειας και ακολούθως σε συνεχή συστήματα (με τη χρήση βιοαντιδραστήρα) για πιο ασφαλή συμπεράσματα ως προς την παραγωγικότητα σε βιομηχανικό επίπεδο. Κατά τις πειραματικές δοκιμές που έγιναν χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις ακατέργαστης γλυκερόλης με σκοπό τη μελέτη της επίδρασής της στον μεταβολισμό των μικροφυκών. Δοκιμάστηκαν επίσης, διαφορετικές μονοχρωματικές πηγές φωτός σε μικτότροφα συστήματα καλλιέργειας, τα οποία όπως αποδείχθηκε ενεργοποιούν διαφορετικά μεταβολικά μονοπάτια και οδηγούν σε παραγωγή διαφορετικών μεταβολικών προϊόντων. Μελετήθηκε επίσης, η επίδραση του φωτισμού στον φαινότυπο των υπό εξέταση μικροφυκών., καθώς και της έλλειψης αζώτου από το θρεπτικό μέσο στην παραγωγικότητα λιπιδίων ορισμένων ειδών μικροφυκών.
Στο ετερότροφο σύστημα καλλιέργειας παρατηρήθηκε η υψηλότερη παραγωγή σε βιομάζα, (18.4 g/L ξηρής βιομάζας), καθώς και η υψηλότερη απόδοση βιομάζας ως προς την κατανάλωση της ακατέργαστης γλυκερόλης (Yx/s=0.23g/g), κατά την ανάπτυξη του A. protothecoides, σε υπόστρωμα με 80 g/L συγκέντρωση ακατέργαστης γλυκερόλης. Ετερότροφα, σε ικανοποιητικό βαθμό, αλλά σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις ακατέργαστης γλυκερόλης αναπτύχθηκαν και τα στελέχη C. vulgaris (με μέγιστη παραγωγή βιομάζας ίση με 0.79 g/L και με απόδοση Yx/s=0.07g/g) ) και S. quadricauda (με 1.47 g/L παραχθείσα βιομάζα, Yx/s=0.16 σε 10 g/L αρχικής συγκέντρωσης γλυκερόλης στο υπόστρωμα). Το S. obliquus αποκλείστηκε από περαιτέρω δοκιμές λόγω χαμηλής ποσότητας παραχθείσας βιομάζα και το T. chuii λόγω αδυναμίας ανάπτυξης με πηγή άνθρακα την ακατέργαστη γλυκερόλη στο υπόστρωμα.
Η απόδοση σε βιομάζα, ο μέγιστος ρυθμός αύξησης και η συσσώρευση των λιπιδίων ήταν μεγαλύτερη κατά την μικτότροφη συγκριτικά με την ετερότροφη ανάπτυξη για τα στελέχη S. quadricauda και C. vulgaris, σε αντίθεση με το A. protothecoides που έδωσε καλύτερα αποτελέσματα κατά την ετερότροφη ανάπτυξη. Σε μικτοτροφικές συνθήκες, για 10 g/L αρχική συγκέντρωση ακατέργαστης γλυκερόλης στο υπόστρωμα η παραγωγή βιομάζας του S. quadricauda ήταν υψηλότερη (1.86 g/L) στο πορτοκαλί φως. Το C. vulgaris έδωσε την μεγαλύτερη παραγωγή βιομάζας (1.68 g/L) στο μπλε φως σε 20 g/L αρχική συγκέντρωση ακατέργαστης γλυκερόλης στο υπόστρωμα. Το μήκος κύματος του φωτός επηρέασε σημαντικά τη μορφολογία και τον φαινότυπο των κυττάρων, τον ρυθμό αύξησης και την παραγωγή βιομάζας και μεταβολιτών και για τα δύο μικροφύκη, δυνητικά ρυθμίζοντας τη δραστηριότητα διαφορετικών μεταβολικών οδών.
Τα δεδομένα που προέκυψαν κατά τις δοκιμές σε ημιδιαλείποντος έργου συστήματα καλλιέργειας έδωσαν ασφαλή συμπεράσματα για την επίδραση της πηγής αζώτου στην ανάπτυξη των μικροφυκών. Η διαθεσιμότητα αζώτου ασκεί ισχυρή επίδραση στη βιοχημική σύνθεση των μικροφυκών. Πράγματι, υπό συνθήκες επάρκειας αζώτου στο θρεπτικό μέσο υπήρχε μια τάση για συσσώρευση πρωτεϊνών, ενώ υπό συνθήκες πενίας αζώτου η βιομάζα ήταν πλούσια σε λιπίδια.
Το σύστημα συνεχούς καλλιέργειας ήταν μια αποτελεσματική μέθοδος για τη μελέτη της κινητικής αύξησης, της κατανάλωσης του υποστρώματος και της παραγωγής μεταβολιτών υψηλής αξίας του A. protothecoides σε διαφορετικές συγκεντρώσεις ακατέργαστης γλυκερόλης (30 g/L και 50 g/L) και του C. vulgaris σε συγκεντρώσεις (20g/L και 30 g/L), υπό ετερότροφες και μικτότροφες συνθήκες. Για το A. protothecoides, η αυξημένη αρχική συγκέντρωση ακατέργαστης γλυκερόλης στην ετερότροφη καλλιέργεια προκάλεσε μειωμένη παραγωγικότητα βιομάζας και αυξημένη συγκέντρωση εναπομένουσας γλυκερόλης στο θρεπτικό μέσο που δεν καταναλώθηκε, ενεργώντας πιθανότατα ως περιοριστικός για την αύξηση παράγοντας. Το A. protothecoides, σε αντίθεση με άλλα είδη Chlorella, εμφάνισε καλύτερες παραμέτρους ανάπτυξης σε ετερότροφες συνθήκες σε σύγκριση με τις μικτότροφες, όπως προσδιορίστηκε από την υψηλότερη παραγωγικότητα του συστήματος (Pmax), τον υψηλότερο ρυθμό αύξησης,, πράγμα που σημαίνει ότι το συγκεκριμένο μικροφύκος μπορεί να αναπτυχθεί καλύτερα και γρηγορότερα, αξιοποιώντας πιο αποτελεσματικά το υπόστρωμα. Φαίνεται λοιπόν ότι το A. protothecoides αποδίδει καλύτερα υπό ετερότροφες συνθήκες. Η ετεροτροφία είχε επίσης θετικό αντίκτυπο στην παραγωγή λιπιδίων, πρωτεϊνών και υδατανθράκων, αλλά όχι σημαντική επίδραση στα προφίλ λιπαρών και αμινοξέων.
Αντίστοιχα για το C. vulgaris το συμπέρασμα που προέκυψε, ήταν ότι τα διαφορετικά μήκη φωτός οδηγούν σε ενεργοποίηση διαφορετικών μεταβολικών μονοπατιών βιοσύνθεσης και συσσώρευσης διαφορετικών μεταβολικών προϊόντων, πράγμα που δεν είχε μελετηθεί επαρκώς έως τώρα και χρίζει περαιτέρω διερεύνησης σε μελλοντικές ερευνητικές δραστηριότητες με σκοπό διερεύνηση του μεταβολικού φαινοτύπου το μικροοργανισμού και πως αντιδρά στις διαφορετικές καλλιεργητικές στρατηγικές. Τέλος, κατά την ανάπτυξη του μικροφύκους σε συνεχές σύστημα καλλιέργειας, τόσο υπό ετερότροφες όσο και υπό μικτότροφες συνθήκες, διαπιστώθηκε ότι μικτότροφα, η αύξηση και η παραγωγή μεταβολιτών ήταν πολύ υψηλότερη συγκριτικά με την ετερότροφη ανάπτυξη, ενώ και η ακατέργαστη γλυκερόλη αφομοιώθηκε πιο αποδοτικά.
Συμπερασματικά, η παρούσα διδακτορική έρευνα έδωσε νέες γνώσεις σχετικά με την εφαρμογή των μικροφυκών στην αξιοποίηση ακατέργαστης γλυκερόλης, εστιάζοντας στην παραγωγικότητα βιομάζας, τη βιοσύνθεση μεταβολιτών καθώς και το βιοχημικό προφίλ της βιομάζας, ενώ διερευνήθηκαν οι καλλιεργητικές παράμετροι, ώστε να προσδιοριστούν οι άριστες συνθήκες γι’ αυτό το σκοπό.
In the recent years, microalgae biotechnology has attracted the interest of the scientific and industrial communities as a primary biological resource for the production of a wide range of high-value-added products (antioxidants, proteins, fatty acids, vitamins, natural colorants, etc.). These products find broad applications in industries such as animal feed, food, energy, health, and more. Microalgae are considered to be a significant pillar of circular bioeconomy as they can be engaged in the valorization of organic wastes and the production of high-value biomass.
Typically, microalgae are photosynthetic microorganisms, but they can also grow using available in the growth environments carbon sources such as sugars, glycerol, oxalic acid, etc. While they are primarily autotrophic microorganisms, they have been industrially employed in heterotrophic and mixotrophic cultivation systems but utilizing the organic carbon provided in their growth substrate. Crude glycerol is a byproduct of the biodiesel industry, which often becomes waste with a negative impact on the environment due to its excessive, unused quantities.
This doctoral research focuses on the utilization of industrial glycerol and its bioconversion into high-value-added products through microalgae biorefineries. For the utilization of crude glycerol several species of freshwater microalgae, i.e. Chlorella vulgaris, Auxenochlorella protothecoides, Scenedesmus obliquus, Scenedesmus quadricauda, and a marine microalga, Tetraselmis chuii were tested. All species were examined for their potential to grow in environments where crude glycerol was the primary carbon source, in different concentrations..
In all the experiments series conducted, it was observed that the biochemical profile of the produced biomass (content of primary and secondary metabolites) was influenced by the selected cultivation parameters, including light intensity and the absence of nutrients such as nitrogen. Consequently, this study focused on investigating novel ways of cultivating these microalgal species in both heterotrophic and mixotrophic cultivation modes. Experiments were conducted in batch and semi-continuous cultures in flasks,, followed -in some cases- by continuous cultures in bioreactors in order to obtain more robust conclusions regarding productivity at an industrial scale. The experiments involved different concentrations of crude glycerol to study its impact on microalgal metabolism. Additionally, various monochromatic light sources were tested in mixotrophic cultivation systems, which were found to activate different metabolic pathways and lead to the production of distinct metabolic products. Furthermore, the present study examined the influence of lighting conditions on the phenotype of the microalgae. One more parameter examined was the impact of nitrogen deficiency in the growth medium on the lipid productivity of certain microalgal species. Overall, this doctoral research explores the potential of utilizing crude glycerol as a carbon source for microalgae cultivation and demonstrates the way in which various cultivation parameters can influence the biochemical composition of the microalgal biomass, ultimately aiming to optimize productivity for industrial applications.
In the heterotrophic cultivation systems, the highest biomass production (18.4 g/L dry biomass) was observed, along with the highest biomass yield concerning the consumption of crude glycerol (Yx/s=0.23 g/g), during the growth of A. protothecoides on a substrate with an initial glycerol concentration of 80 g/L. Heterotrophic growth was also achieved at lower concentrations of untreated glycerol for the strains C. vulgaris, which produced (0.79 g/L dry biomass with a biomass yield Yx/s=0.07 g/g) at an initial crude glycerol concentration of 10 g/L, and S. quadricauda, which produced (1.47 g/L biomass with Yx/s=0.16 g/g) at an initial glycerol concentration of 10 g/L in the substrate. S. obliquus was excluded from further tests due to the low quality of the produced biomass, while T. chuii was excluded as well due to its inability to grow using untreated glycerol as the carbon source in the substrate.
Biomass yields, maximum growth rates, and lipid biosynthesis were higher in mixotrophic conditions compared to heterotrophic growth for the strains S. quadricauda and C. vulgaris, whereas A. protothecoides showed better results in heterotrophic growth. Under mixotrophic conditions, with an initial glycerol concentration of 10 g/L in the substrate, S. quadricauda exhibited higher biomass production (1.86 g/L) in orange light. C. vulgaris showed the best biomass production (1.68 g/L) in blue light with an initial glycerol concentration of 20 g/L in the substrate. The wavelength of light significantly affected cell morphology, phenotype, growth rate, biomass production, and metabolite production for both microalgae, potentially regulating different metabolic pathways.
The data obtained during experiments in semi-continuous cultivation systems provided secure conclusions regarding the impact of nitrogen source availability on microalgae growth. Nitrogen availability had a strong effect on the biochemical composition of the microalgae. Under conditions of nitrogen sufficiency in the growth medium, there was a tendency to accumulate proteins, whereas under nitrogen deficiency conditions, biomass was rich in lipids.
The continuous cultivation system proved to be an effective method for studying the growth kinetics, the substrate assimilation, and the production of high-value metabolites in both A. protothecoides and C. vulgaris at different concentrations of untreated glycerol (30 and 50 g/L for A. protothecoides and 20 and 30 g/L for C. vulgaris) under heterotrophic and mixotrophic conditions.
A. protothecoides, unlike other Chlorella species, exhibited better growth parameters under heterotrophic conditions compared to mixotrophic conditions, as evidenced by the higher productivity of the system (Pmax), the higher growth rate, and the lower KS values, indicating that this specific microalga can grow better and faster, utilizing the substrate more efficiently under these conditions. However, increased initial concentration of untreated glycerol in heterotrophic conditions led to reduced biomass productivity and increased accumulation of residual glycerol in the medium, acting as a limiting factor for growth. Overall, A. protothecoides appears to perform better as a heterotrophic organism. Heterotrophy also had a positive impact on lipid, protein, and carbohydrate production in microalgal cells, but no significant effect on fatty acid and amino acid profiles, and hence, lipid and protein composition.
Similarly, for C. vulgaris, the conclusion drawn was that different light wavelengths lead to the activation of different metabolic pathways and the accumulation of different metabolic products. This aspect had not been sufficiently studied until now and requires further investigation in future aiming at analyzing the metabolic phenotype of the microalga under the influence of light and how different cultivating strategies could influence its metabolic pathways to produce target metabolites. Finally, during the growth of the microorganism in a continuous system, it was observed that in mixotrophic conditions, growth and metabolites production were much higher and crude glycerol was assimilated more efficiently, compared to heterotrophic growth.
In conclusion, this doctoral research has provided new insights into the application of microalgae for the utilization of crude glycerol, focusing on biomass productivity, metabolite synthesis, and their biochemical profiles. Cultivation parameters were also explored to determine the optimal conditions for this purpose.
