Βιολογική αντιμετώπιση αφλατοξινών στο καλαμπόκι με τη χρήση μη-τοξικογόνων στελεχών του μύκητα Aspergillus flavus

Abstract

Ο μύκητας Aspergillus flavus προσβάλλει τον αραβόσιτο προκαλώντας σήψεις και παραγωγή καρκινογόνων μυκοτοξινών, των αφλατοξινών, με ιδιαίτερα επιβλαβείς συνέπειες στην παραγωγή αγροτικών προϊόντων και ζωοτροφών. Η χρήση χημικών μυκητοκτόνων για τον έλεγχο της μόλυνσης από μυκοτοξίνες στην τροφική αλυσίδα είναι όλο και πιο αμφιλεγόμενη. Ως εκ τούτου, διερευνώνται πιο φιλικές προς το περιβάλλον μέθοδοι. H επικρατέστερη προσέγγιση για τη βιολογική αντιμετώπιση του Aspergillus flavus και των αφλατοξινών που παράγει, είναι η εφαρμογή σκευασμάτων με βάση μη τοξικογόνα στελέχη του ίδιου του μύκητα. Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε έλεγχος της αφλατοξικογόνου ικανότητας 99 ενδημικών απομονώσεων Aspergillus section Flavi, που συλλέχθηκαν τα έτη 2014 και 2016 από περιοχές της Θεσσαλίας και Μακεδονίας. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε αξιολόγηση της τοξικογόνου ικανότητας όλων των στελεχών με τη χρήση της χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας (Thin Layer Chromatography - TLC). Οι 36 εκ του συνόλου των απομονώσεων αυτών χαρακτηρίστηκαν ως αφλατοξικογόνες ενώ οι υπόλοιπες 63 αποδείχτηκε ότι δεν παράγουν αφλατοξίνη B1 και χαρακτηρίστηκαν ως μη τοξικογόνες. Ακολούθως, οι 63 μη τοξικογόνες απομονώσεις A.flavus αξιολογήθηκαν, in vitro, ως προς την ικανότητά τους να μειώνουν τις παραγόμενες αφλατοξίνες των τοξικογόνων στελεχών, σε συγκαλλιέργεια με δύο ισχυρά τοξικογόνα στελέχη, BAF47 και AAF24. Ακολούθησε εξαγωγή των αφλατοξινών και ανάλυση με τη χρήση χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας (TLC). Παρατηρήθηκε ότι 34 απομονώσεις εκ των 63 μη τοξικογόνων αποδείχθηκαν αρκετά αποτελεσματικές σε συγκαλλιέργεια με το τοξικογόνο στέλεχος AAF24 αφού κατάφεραν να παρεμποδίσουν έως και πλήρως την παραγωγή αφλατοξίνης Β1 από το τοξικογόνο στέλεχος. Αντίστοιχα, για το τοξικογόνο στέλεχος BAF47, 13 απομονώσεις εκ των 63 μη τοξικογόνων κατάφεραν να παρεμποδίσουν έως και πλήρως την παραγωγή αφλατοξίνης Β1. Συνολικά 38 μη τοξικογόνες απομονώσεις, παρεμπόδισαν έως και πλήρως την παραγωγή αφλατοξινών από τα τοξικογόνα στελέχη AAF24 και BAF47. Στη συνέχεια, οι αποτελεσματικές μη τοξικογόνες απομονώσεις A.flavus, αξιολογήθηκαν έναντι των παραγόμενων αφλατοξινών των δύο ισχυρά τοξικογόνων στελεχών, AAF24 και BAF47, in situ, σε σπόρους καλαμποκιού. Η ποσοτική ανάλυση των παραγόμενων αφλατοξινών διεξήχθη με την ανοσοχημική μέθοδο ELISA. Από την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων φαίνεται πως όλες οι μη τοξικογόνες απομονώσεις παρεμποδίζουν στατιστικά σημαντικά την παραγωγή αφλατοξινών από τα δύο τοξικογόνα στελέχη AAF24 και BAF47. Tα επίπεδα παρεμπόδισης παραγωγής αφλατοξινών έφτασαν το 98% συγκριτικά με τον μάρτυρα BAF47 και 96% συγκριτικά με το AAF24. Συνεπώς, η in vitro ικανότητα των μη τοξικογόνων απομονώσεων A.flavus να παρεμποδίζουν την παραγωγή αφλατοξινών, επιβεβαιώθηκε και in situ, σε σπόρους καλαμποκιού. Επιπρόσθετα, οι μη τοξικογόνες απομονώσεις A.flavus κατηγοριοποιήθηκαν σε ομάδες βλαστικής συμβατότητας (VCGs) με σκοπό τον έλεγχο της προσαρμοστικότητάς τους στο τοπικό περιβάλλον. Βάσει των δοκιμών που πραγματοποιήθηκαν, η κατάταξή τους έγινε σε 23 διακριτές ομάδες βλαστικής συμβατότητας ενώ η πλειοψηφία των απομονώσεων φαίνεται ότι ανήκει κυρίως σε τρεις μεγάλες ομάδες από αυτές. Τέλος, οι 35 αποτελεσματικότερες μη τοξικογόνες απομονώσεις A.flavus εφαρμόστηκαν σε σπάδικες καλαμποκιού, ύστερα από μόλυνση τους με τοξικογόνα στελέχη, σε συνθήκες αγρού. Παρατηρήθηκε ότι τα μη τοξικογόνα στελέχη διέφεραν ως προς την ικανότητά τους να μειώνουν την αφλατοξίνη. 11 από αυτά κατάφεραν να παρεμποδίσουν την παραγωγή αφλατοξινών σε ποσοστά που υπερβαίνουν 94 % φθάνοντας έως και 100 %, σε σχέση με το μάρτυρα. Εν κατακλείδι, σύμφωνα με τα ευρήματα που παρουσιάστηκαν παραπάνω, ορισμένα από τα μη τοξικογόνα στελέχη αυτά θα μπορούσαν δυνητικά να αποτελέσουν βιολογικούς παράγοντες για την αντιμετώπιση του A.flavus και των παραγόμενων αφλατοξινών του, στα πλαίσια ενός ολοκληρωμένου συστήματος διαχείρισης για την καλλιέργεια του καλαμποκιού στην Ελλάδα.

Aspergillus flavus causes ear and grain molds in maize and produces carcinogenic mycotoxins, aflatoxins, with particularly harmful consequences in the production of agricultural products and animal feed. The use of chemical fungicides to control mycotoxin contamination is increasingly controversial and regulated. More environmentally friendly methods are therefore being explored. The use of atoxigenic Aspergillus strains as biological agents, appears to be the most promising available method of reducing aflatoxin accumulation. In the present study, the aflatoxigenic capacity of 99 endemic Aspergillus section Flavi isolates, collected in 2014 and 2016 from the regions of Thessaly and Macedonia, was tested. An evaluation of the ability to produce aflatoxins of all strains was initially performed using thin-layer chromatography (TLC). 36 of these isolates were characterized as aflatoxigenic while the remaining 63 were proved to not produce aflatoxin B1 and were therefore characterized as non-toxicogenic. Subsequently, the 63 non-toxigenic A.flavus isolates were evaluated, in vitro, for their ability to reduce the aflatoxin production in co-culture with two highly toxigenic strains, BAF47 and AAF24. The aflatoxin extraction and analysis were carried out using thin layer chromatography (TLC). It was observed that 34 out of the 63 non-toxigenic isolates were proven to be effective in co-culture with the toxigenic strain AAF24, i.e. they managed to completely inhibit the production of aflatoxin B1, produced by the toxigenic strain. Correspondingly, 13 isolates out of the 63 non-toxigenic strains were able to completely inhibit the aflatoxin B1 production of the toxigenic strain BAF47. In total, 38 non-toxigenic isolates were capable of inhibiting, even completely, the aflatoxin production of the toxigenic strains AAF24 and BAF47. Then, the inhibitory capacity of the most effective atoxigenic A.flavus strains was evaluated in maize kernels in situ. The produced aflatoxins were quantified using ELISA and it was demonstrated that all the non-toxigenic isolates inhibited the production of aflatoxins by the two highly toxigenic strains AAF24 and BAF47 statistically significantly. Aflatoxin production inhibition levels reached 98% compared to the control, BAF47, and 96% compared to AAF24. Therefore, the in vitro ability of non-toxigenic A.flavus isolates to inhibit aflatoxin production was also confirmed in situ, in maize. In addition, the non-toxigenic A.flavus isolates were clustered into vegetative compatibility groups (VCGs), in order to check their adaptability to the environment conditions. Based on the experimental results, the atoxigenic strains were classified into 23 distinct vegetative compatibility groups while the majority of them appeared to belong mainly to three major groups. Finally, the competitive ability of 35 non-toxigenic strains of A.flavus on the production of aflatoxins in field experiments, during co-inoculation with an aflatoxigenic isolate in maize kernels, was evaluated. It was demonstrated that non-toxigenic strains differed in their ability to reduce aflatoxin. 11 of these isolates presented significant reductions in aflatoxin contamination in the range of 94% up to 100%, compared to the control. In conclusion, according to the above-mentioned findings, some of these non-toxigenic strains could potentially be used as biological agents for the control of A.flavus and its produced aflatoxins, as part of an integrated management system for the protection of maize cultivations in Greece.