Μελέτη και ταυτοποίηση της βιοσυνθετικής οδού ανθοκυανών σε ερυθρόβρακτους φαινοτύπους Sideritis raeseri

Abstract

Το είδος S. raeseri, γνωστό και ως «τσάι του βουνού», είναι φυτικό ενδημικό είδος της Βαλκανικής Χερσονήσου και κατατάσσεται στα αρωματικά φυτά, λόγω της χημικής του σύστασης που χαρακτηρίζεται από την παρουσία δευτερογενών μεταβολιτών. Ο σιδερίτης έχει εμπορική και οικονομική αξία, καθώς καταναλώνεται ευρέως ως ρόφημα και καταπραΰνει συμπτώματα γρίπης, αναπνευστικών λοιμώξεων και δυσπεψίας, ενώ θεωρείται ότι έχει αντιφλεγμονώδη και αντιοξειδωτική δράση. Η αντιοξειδωτική του δράση αποδίδεται κυρίως στην παρουσία προϊόντων του δευτερογενούς μεταβολισμού. Σε άγριους πληθυσμούς S. raeseri στη Βόρεια Ελλάδα εντοπίστηκαν φαινότυποι που αναπτύσσουν ερυθρά βράκτεια φύλλα, αντί για πράσινα, που είναι ο φυσιολογικός φαινότυπος, κάτι το οποίο θεωρήθηκε ως αρνητικό χαρακτηριστικό λόγω του ότι ήταν ανεπιθύμητο από το καταναλωτικό κοινό. Η παρουσία των «ερυθρόβρακτων» φαινοτύπων οφείλεται στην παραγωγή ανθοκυανών στα βράκτεια με αποτέλεσμα τον κόκκινο-καφέ χρωματισμό. Οι ανθοκυανίνες είναι φαινολικές ενώσεις και μπορεί να έχουν προστατευτικό ρόλο για το φυτό έναντι βιοτικών ή αβιοτικών καταπονήσεων. Το μονοπάτι βιοσύνθεσης των ανθοκυανών έχει αποσαφηνιστεί σε άλλα είδη, επομένως τα γονίδια που συμμετέχουν σε αυτό είναι γνωστά. Ο κύριος στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η απομόνωση και ο λειτουργικός χαρακτηρισμός των κυριότερων γονιδίων που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση ανθοκυανών, αλλά και η μέτρηση της σχετικής τους έκφρασης στα «ερυθρόβρακτα» φυτά. Γι’ αυτό το σκοπό, τα υποψήφια γονίδια DFR, ANS και UFGT απομονώθηκαν και κλωνοποιήθηκαν σε φορείς για να χαρακτηριστούν σε ετερόλογα συστήματα έκφρασης, όπως οι ζυμομύκητες (Saccharomyces cerevisiae). Αυτό δεν κατέστη εφικτό, καθώς στα προϊόντα των γονιδίων δεν ανιχνεύθηκε δραστικότητα μέσω υγρής χρωματογραφίας. Ωστόσο, τα αποτελέσματα της ανάλυσης RT-qPCR έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν τα κυριότερα ένζυμα που συμμετέχουν σε αυτή τη βιοσυνθετική οδό ήταν σημαντικά αυξημένα σε σχέση με τα επίπεδα έκφρασης των ίδιων γονιδίων στο φαινότυπο με πράσινα βράκτεια. Τέλος, όλη η έρευνα της παρούσας εργασίας συμβάλλει στη λειτουργική ανάλυση των γονιδίων που πιθανόν βοηθούν στη βελτίωση των γονοτύπων με ερυθρά βράκτεια, αλλά και ταυτοποίηση αυτών των γονιδίων που η υπερέκφρασή τους οδηγεί στην παραγωγή περισσότερων δευτερογενών μεταβολιτών που είναι επιθυμητοί για τη φαρμακοβιομηχανία.

S. raeseri, also known as "mountain tea", is a plant species native to the Balkan Peninsula and is classified as an aromatic plant due to its chemical composition characterized by the presence of secondary metabolites. S. raeseri has commercial and economic value, as it is widely consumed as a beverage and heals symptoms of flu, respiratory infections and indigestion, and is considered to have anti-inflammatory and antioxidant properties. Its antioxidant activity is mainly attributed to the presence of products of secondary metabolism. In wild populations of S. raeseri in Νorthern Greece, phenotypes developed red bracts instead of green bracts, that is the normal phenotype, which was considered as a negative characteristic because it was undesirable by the consuming public. The presence of the “red-brown” phenotypes is due to the production of anthocyanins in the bracts resulting in a red-brown coloring. Anthocyanins are phenolic compounds and may have a protective role for the plant against biotic or abiotic stresses. The biosynthetic pathway of anthocyanins has been elucidated on other species, therefore the genes involved in it are known. The main objective of the present thesis is the isolation and functional characterization of the main genes involved in anthocyanin biosynthesis and the measurement of their relative expression in “red-brown”-bracts plants. For this purpose, candidate genes DFR, ANS and UFGT were mined in Sideritis available de novo transcriptome and cloned into vectors in order to be functionally characterized in heterologous expression systems such as yeast (Saccharomyces cerevisiae). Through our first attempt to express the genes in yeast no activity was detected in the gene products by liquid chromatography. However, the results of RT-qPCR analysis showed that the expression levels of genes encoding the main enzymes involved in this biosynthetic pathway were significantly increased compared to the expression levels of the same genes in the green-bract phenotype. In conclusion, all this research contributes to the functional analysis of genes that may help to improve genotypes with red bracts, but also to the identification of those genes whose overexpression leads to the production of more secondary metabolites that are desirable for the pharmaceutical industry.